地黄连作效应研究进展

地黄玄参科地黄属多年生草本植物,是常用的中药之一。实验研究进展中,选择具有典型连作障碍的地黄作为实验材料。结果表明,在幼苗期后65天,连作引起地黄细胞膜经过氧化作用,使膜受到损伤,叶片出现叶绿素含量降低,致使叶片黄化,导致光合效能低,从而致使地黄产量降低。研究连作效应对提高地黄产量具有极其重要作用。     

塔城地区某奶牛场牛支原体的分离鉴定及药敏试验

为确定新疆塔城地区某奶牛场部分断奶犊牛出现咳嗽、流脓性鼻涕、腹泻等症状的发病病因,本试验通过对采集到的发病犊牛鼻拭子样品进行分离培养、形态学观察、生化试验、16S rRNA基因和oppD/F基因PCR扩增与测序、药敏试验等。分离培养显示3株分离株在改良Thiaucourt’s琼脂培养基平板上生长出典型的“煎蛋样”菌落,狄氏染色菌落中心呈深蓝色。生化试验中分离株不发酵葡萄糖与甘露醇,不水解精氨酸,不分解尿素,明胶液化试验为阴性。PCR扩增分离株16S rRNA基因测序结果显示,分离株与GenBank数据库中牛支原体16S rRNA基因序列的相似性在98.73%以上;牛支原体特异性基因oppD/F阳性且相似性达99.74%以上。通过药敏试验从9种药物里选择出替加环素、红霉素2种最为敏感的药物。研究结果表明,造成此次犊牛肺炎的病原菌为牛支原体,为临床防治牛支原体病提供了参考。     

鼠源细胞TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为对鼠源细胞进行鉴别检测,以鼠线粒体16S rRNA基因序列为靶位点设计特异性引物及探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并评价该方法的特异性及敏感性。结果显示,所建立的检测方法特异性好,针对鼠源细胞基因组荧光定量PCR扩增曲线良好,其他物种来源细胞基因组及生物制品原辅材料未出现特异性扩增曲线;敏感性高,基因拷贝数检出限度为45.3拷贝。本试验建立的荧光定量PCR检测方法能够有效地对鼠源细胞进行快速检测,为细胞质量控制提供了有效方法。     

PRV、PCV2与PPV三重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)与猪细小病毒(PPV)的三重PCR方法,根据Gen Bank登录的病毒相关基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上3种病毒的PCR诊断方法,扩增的目的片段长度分别为192 bp(PRV)、255 bp(PCV2)和759 bp(PPV)。对PRV、PCV2和PPV的核酸检测最低浓度分别为:2.5×10-2,2.2×10-3和3.7×10-2ng,证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性。应用该方法对56份临床样品进行检测发现,PRV、PCV2和PPV的阳性率分别为16.1%、50.0%和19.6%,二重感染率为12.5%,三重感染阳性率为3.6%。该方法的成功建立为快速高效地检测以上3种病毒提供了有效手段。     

仔猪致病性大肠杆菌的PCR快速检测

在对大肠杆菌主要毒力因子基因序列分析的基础上,建立了用于快速检测毒素、菌毛和毒力岛(HPI)的PCR方法;用所建立的多重PCR或单重PCR方法,对江苏部分地区临床疑似大肠杆菌感染的新生仔猪腹泻样品110份和健康新生仔猪粪便35份进行了快速检测。结果表明:HPI已经成为致仔猪腹泻大肠杆菌最常见的毒力因子(58.18%),其次是肠毒素(LT1 10.91%、ST2 8.18%、ST1 2.73%),并揭示了至少46.36%的病例与HPI+大肠杆菌感染相关,11.82%的病例与HPI+大肠杆菌和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)混合感染相关,仅有6.36%的病例与ETEC感染相关。菌毛仍然是ETEC的主要毒力因子,其中987P+菌株6.36%、K88+菌株3.64%、K99+菌株0.91%,未发现F41+菌株。此外,通过对健康新生仔猪样品的检测,发现48.57%的动物携带HPI+大肠杆菌,5.71%的动物携带ETEC(主要为ST2+),未发现所检测的其他毒力因子,这表明HPI+大肠杆菌很可能是条件性致病菌。     

Real-time PCR方法检测高脂饲喂小鼠肝脏CYP2A5的表达

为了建立非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型小鼠肝组织中CYP2A5表达的实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)方法。高脂饮食诱导小鼠至8周,采用qRT-PCR方法检测小鼠肝脏中CYP2A5的表达水平,同时评价该方法的特异性。建立了小鼠肝组织中CYP2A5的SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,结果显示,该方法的溶解曲线为单峰,同时核酸电泳显示一条特异性条带。检测结果表明,高脂诱导的NAFLD小鼠肝组织中CYP2A5的表达水平极明显高于正常对照组(P0.01)。表明该实时荧光定量PCR方法,特异性好、灵敏度强,为进一步研究小鼠CYP2A5的表达提供了试验基础。     

兔源强毒力金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、特异性强且敏感性高的兔源强毒力金黄色葡萄球菌检测方法,本试验根据金黄色葡萄球菌pvl基因的保守序列设计了特异性的引物和探针,通过反应条件的优化,建立了检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法耗时短,仅需约50 min就能完成检测,较已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法均省时;该方法特异性强,对兔源低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌、大肠杆菌和阴性对照(灭菌ddH₂O)均无交叉反应;该方法敏感性高,最低检测限为10拷贝/μL,分别是已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的1 000倍和10倍。此外,该方法重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。应用该方法检测126份已知结果的临床样品,检测结果与已知结果、已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的检测结果完全一致。该方法的建立不仅丰富了兔源强毒力金黄色葡萄球菌的检测方法,也为该菌的快速检测提供了更有力的技术支持。     

空肠弯曲杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）是一种人兽共患病病原菌,给养殖业带来了较大经济损失。为实现对空肠弯曲杆菌的快速检测,针对其MapA基因序列设计特异性引物,优化反应条件和反应体系,建立了空肠弯曲杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估。结果显示：建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,仅能特异性扩增出空肠弯曲杆菌,对胎儿空肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌无交叉反应;敏感性较强,最低检测限为6.42 copies/μL;以5个稀释度的重组质粒为模板分别进行组内和组间重复性试验,发现组内和组间Ct值变异系数（CV）均小于2.50%,说明该方法具有良好的可重复性。结果表明,本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR具有良好的特异性、敏感性及重复性,可用于空肠弯曲杆菌的快速诊断和流行病学调查。     

甜瓜黄斑病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法

为建立检测甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus, MYSV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)方法。基于MYSV核衣壳蛋白基因保守序列设计qPCR特异性引物对,针对引物退火温度、引物浓度、特异性和敏感性进行系列优化。结果显示,优化后的qPCR方法最适退火温度为61.3℃,最适引物浓度为0.65μmol·L^-1,特异性强,灵敏度高,比PCR高100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的qPCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.999 7。实验样品验证表明建立的qPCR方法可用于MYSV的定量检测。     

薄壳山核桃疮痂病菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

疮痂病是薄壳山核桃上最具毁灭性的病害,带菌植物材料是传播疮痂病的重要来源。准确、灵敏、快速的检测方法可为该病害流行规律调查和防控提供有力的依据。本文通过比较薄壳山核桃疮痂病菌Venturia effusa及其近似种之间的ITS序列差异,设计了特异性引物和TaqMan探针,建立了薄壳山核桃疮痂病菌的荧光定量PCR检测方法。特异性检测结果表明,该方法可以检测不同地区的薄壳山核桃疮痂病菌菌株,而对其近似种以及薄壳山核桃上的其他真菌均没有信号。本研究建立的检测方法对薄壳山核桃疮痂病菌DNA的最低检测限可达0.5 pg/μL。该方法用于田间样品检测时,检测时间仅需1 h,远快于常规的分离培养法。本研究建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法为薄壳山核桃疮痂病菌的快速检测和监测提供了有力工具。