德宏州番茄病毒病发生情况调查及其毒源种类

对德宏州番茄主产区病毒病发生情况进行调查,番茄病毒病在德宏州主要番茄主产区均有发生,发病症状主要以黄化曲叶、皱缩、矮化、花叶、蕨叶、脉突、叶片发紫为主,单独或混合发生,一般发病率在5%～30%,严重的达80%以上,个别田块达100%。对采自德宏州4个县市的85份番茄样品进行了DAS-ELISA、dot-ELISA检测以及PCR检测。检测结果表明,在检测的85份样品中,有58份番茄样品感染了所检测病毒,病毒检出率为68.24%,病毒种类有12种,其中以双生病毒科的泰国番茄黄化曲叶病毒(TomatoSyellowSleafScurlSThailandSvirus)为主,占27.06%,其次是番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spotted virus,TZSV)占22.41%,烟草曲茎病毒(TobaccoScurlySshootSvirus,TbCSV)占7.06%,中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)占5.17%,越南番茄黄化曲叶病毒(TomatoSyellowSleafScurlSSVietnam virus)占3.45%。     

牛星状病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛星状病毒(BAstV)是我国新发的犊牛腹泻病原,本试验的目的是建立检测BAstV的Real-time PCR方法。根据BAstV流行株的ORF1a基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BAstV的Real-time PCR方法。结果表明,该检测方法的Ct值与标准品模板在1.36×10¹~1.36×10⁸拷贝/μL线性关系良好,相关系数R²=0.999,扩增效率为93.79%;该方法可特异性检出BAstV,对犊牛腹泻其他相关病原呈阴性;最低检测下限为13.6拷贝/μL;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月至2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本进行检测,BAstV的检出率为18.1%(40/221),采样场阳性率为100.0%(14/14)。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BAstV的检测和流行病学调查提供了有力手段。     

小麦Glu-3位点基因拷贝数的变异分析

【目的】基因拷贝数变异是一种常见又重要的基因结构变异,往往影响个体表型。低分子量麦谷蛋白（low-molecular-weight glutenin subunit,LMW-GS）是小麦贮藏蛋白的主要组成部分,位于Glu-3位点。小麦作为异源六倍体,其庞大且复杂的基因组结构导致难以利用传统方法检测目的基因的拷贝数,针对小麦基因组,筛选可靠稳定的内参基因和体系,探索适合复杂基因组的拷贝数变异测定技术,测定Glu-3位点LWM-GS基因拷贝数。【方法】以Acc1为内参基因,根据基因序列设计内参引物和探针,通过定性和定量PCR测定内参基因在12个普通小麦品种中的拷贝数,分析该基因拷贝数在不同品种间的稳定性;又以小麦品种篙优2018的5个稀释浓度的基因组DNA为模板,利用qRT-PCR验证Acc1内参系统的重复性和准确性;根据Glu-A3位点LMW-GS基因序列设计特异性引物及探针,利用qRT-PCR和ddPCR 2种方法检测8个小麦品种Glu-A3位点基因拷贝数,比较后选择更优的高通量基因拷贝数检测方法;再根据Glu-B3和Glu-D3位点LMW-GS基因序列设计相应的特异性引物及探针,并利用ddPCR技术检测和分析了231份小麦品种的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位点上LMW-GS基因拷贝数。【结果】Acc1在12个普通小麦品种间、同一品种5个DNA稀释浓度间的拷贝数测定结果一致,技术重复间的变异系数仅为0.07%—0.77%,所构建的Acc1内参系统稳定;比较qRT-PCR和ddPCR 2种拷贝数检测方法,8个品种所测的Glu-A3位点拷贝数结果一致,分别为3、5、3、4、3、3、3和3;且ddPCR检测重复间的变异系数为0.30%—1.67%,远低于qRT-PCR的3.14%—12.72%,更加可靠;利用ddPCR对231份普通小麦品种的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位点上LMW-GS基因拷贝检测后分析发现,大多数小麦品种在3个位点上的拷贝数为4,所占频率分别为51.95%、32.03%和28.57%,Glu-3位点总拷贝数变异范围为10—21,变异系数为16.12%。【结论】Acc1内参系统具有良好的稳定性和重复性,可以用作小麦Glu-3位点和其他目的基因拷贝数检测的内参;qRT-PCR和ddPCR均可用于小麦基因拷贝数的检测,但后者更稳定、可靠,且操作简单、检测通量高。     

饲料和饲料原料中致泻性大肠杆菌的检测

[目的]了解饲料及饲料原料中致泻性大肠杆菌的污染情况。[方法]2015—2016年,应用多重PCR技术对463批饲料及饲料原料中致泻性大肠杆菌进行检测。[结果]463批样品共检出12批阳性样品,检出率为2.6%,其中以EPEC、ETEC、EHEC为主。EPEC阳性样品7批,阳性率1.50%;ETEC阳性样品3批,阳性率0.65%;EHEC阳性样品2批,阳性率0.43%。[结论]饲料和饲料原料中致泻性大肠杆菌污染比较严重,应进一步加强管理。     

蜗牛消化酶提取河蟹微孢子虫基因组反应条件的优化

PCR是目前能够特异地检测河蟹微孢子虫的最灵敏的方法。河蟹微孢子虫孢子壁坚厚不易破碎,对许多化学物质有很强的抵抗性,常规的核酸抽提方法效果不够理想。本文通过对比PCR的结果,研究蜗牛消化酶对DNA抽提效果的影响,确定了酶作用的最佳反应条件,提高了PCR检测河蟹微孢子虫的灵敏性。结果显示:蜗牛消化酶提取微孢子虫DNA的酶促反应温度为37℃,底物浓度为20 mg,酶的使用浓度为酶/底物重量比400 mg/g,酶促反应时间为4 h。实验表明,使用蜗牛消化酶处理样品,有助于更加灵敏地检测出微孢子虫。该研究结果将有助于提高河蟹微孢子虫病的检验检测能力,对河蟹微孢子虫的检疫和防治具有积极意义。     

陕西某规模化猪场流行性腹泻诊断与防治

规模化猪场仔猪腹泻是养猪生产的一种常见传染性疾病,严重阻碍养猪业的发展。2010年以来,我国持续暴发仔猪流行性腹泻病毒引起的仔猪腹泻性疾病,因其病原变异较快,疫苗免疫效果差,造成了严重的损失。为了进一步调查了解现阶段仔猪腹泻发生情况,试验通过对陕西省某规模化猪场的仔猪腹泻性疾病进行了流行病学调查,通过临床症状观察,病理变化观察结合荧光定量PCR方法检测。临床表现为病猪尸体消瘦、脱水,皮肤干燥;全身淋巴结肿胀、出血,外观呈暗红色;病理变化表现为心肌松软,有出血斑;胃黏膜底部充血、出血,内容物呈鲜黄色并混有乳白色凝乳块;肾脏表面有数量不等的散在针尖状出血点;肺脏和膀胱也有不同程度的出血点或出血斑;小肠肠壁变薄,肠黏膜萎缩、脱落,肠管内充满乳白色、灰白色或黄绿色液状物。通过荧光定量PCR检测确诊该规模化猪场仔猪腹泻性疾病的病因为流行性腹泻病毒,并根据此规模化猪场仔猪腹泻的发病情况提出合理的防治方案,通过对这该猪场免疫程序优化,仔猪的超时免疫,生物安全措施落实,生产工艺流程优化,各项防控措施的落实,成功的控制了猪流行性腹泻疫情;以上这些综合防控措施对其他规模化猪场防控猪流行性腹泻具有一定的参考价值。     

不同类型烟草种质的烟碱含量变化与相关基因表达水平

为研究不同类型烟草种质的烟碱含量变化规律与相关基因的表达情况,以烤烟K326、香料烟巴斯玛、白肋烟TN90、晾烟马里兰为材料,采用荧光定量PCR技术,测定了烟草不同生育时期上部叶、中部叶、下部叶的烟碱含量与烟碱代谢过程中相关基因PMT、QPT、CYP82E5V2、A622的表达水平。结果表明,随着生育期的推进,烟碱含量缓慢上升,打顶后急剧增加,除巴斯玛打顶后还继续上升外,K326、TN90和马里兰烟均表现为:打顶后烟碱含量急剧增加,后缓慢下降,再渐趋平稳。不同类型烟草种质的PMT在不同生育期均有表达,苗期PMT表达量较高,其变化趋势与烟碱含量的基本一致;QPT在烟草发育前期表达量较高,而后下降,至打顶前1周表达量出现一个峰值,打顶后表达量持续增加,与烟碱含量变化呈正相关;CYP82E5V2表达量在不同生育时期均维持在较高水平,呈波浪型,生长旺期时表达量上升,打顶前后均出现峰值,但巴斯玛成熟期时其表达量下降,打顶前CYP82E5V2表达量与烟碱含量变化呈正相关,打顶后期至成熟期两者呈一定程度的负相关;K326和马里兰烟的A622表达量呈波浪型上升,至成熟时仍维持较高水平,而TN90和巴斯玛在打顶前后1周表达量较高,后表达下降再上升,成熟时表达量较低,与烟碱含量变化无明显一致性。     

旋毛虫Serpin基因在不同发育时期的mRNA表达水平变化及虫体表达特性

为研究旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin),基因在不同发育时期的mRNA表达水平变化,本研究应用实时荧光定量PCR技术对不同发育时期的虫体的Serpin在mRNA表达水平进行检测。同时利用鼠抗重组蛋白血清对Serpin在旋毛虫成虫、新生幼虫、成囊前期幼虫及肌幼虫中进行定位,以鉴定该Serpin基因的表达特性。研究结果显示,在成虫时期,3 d时表达量明显高于6 h和5 d的表达量(P﹤0.05);成囊前期表达量很低,其中18 d时表达量最低(P﹤0.05);肌幼虫时期在26 d、38 d和48 d均有大量表达(P﹤0.05)。免疫荧光染色结果表明,Ts Serpin蛋白在5 d成虫期的体表表达;在新生幼虫和14 d成囊前期幼虫的体内体表均有表达;38 d肌幼虫时期明显可见表皮及体内均有表达。本实验为探究旋毛虫在宿主体内免疫逃避机制奠定基础。