基于最新诊疗方案中抗新型冠状病毒药物的回顾分析与药学监护

2019年12月以来,湖北武汉爆发由新型冠状病毒引发的病毒性肺炎疫情并迅速蔓延,现已确认该新型病毒为SARS-CoV-2.由于目前针对该病毒尚无确切有效的抗病毒药物,给我国公共卫生事业带来了严峻的考验.随着疫情的发展,国家卫生健康委员会下发了最新的《新型冠状病毒肺炎诊疗的方案(试行第七版)》.该文从临床药学角度对最新诊疗方案中所涉及的抗病毒药物进行回顾分析,提出药学监护的重点,并对潜在有效的药物进行展望,以期为抗击新型冠状病毒疫情提供药物使用参考.     

鸡粒细胞巨噬细胞集落刺激因子-猪干扰素α1融合基因在大肠埃希菌中的可溶性表达及其生物学活性研究

为可溶性表达重组鸡粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(ChGM-CSF)与猪干扰素α1(PoIFNα1)融合蛋白,并研究其生物学活性,本研究分别提取鸡、猪肝脏细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增ChGM-CSF和PoIFNα1基因,经linker连接上述两种基因后将其克隆于pET-32a原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE和western blot检测融合蛋白表达产物。在ST细胞/VSV病毒测定系统以细胞病变抑制法滴定该融合蛋白的抗病毒活性;同时用MTT法检测其对鸡淋巴细胞增殖活性的促进作用。结果显示,PCR扩增并融合后的ChGM-CSF和PoIFNα1融合基因约为1000bp,构建重组表达载体后,诱导表达的rChGM-CSF-PoIFNα1融合蛋白分子量约55ku,主要存在于破碎菌体的上清中,表达量较高。Westernblot检测结果显示,该融合蛋白分别能够与ChGM-CSF多抗和PoIFNα单克隆抗体特异性结合,其抗病毒比活性约为1.1×10^6IU/mg,并且具有促进鸡淋巴细胞增殖的活性。本研究为rChGM-CSF-PoIFNα1重组融合蛋白的研制及其相关活性的测定提供实验依据。     

重组犬α6干扰素的酵母表达及其抗病毒活性评价

试验旨在构建犬α6干扰素毕赤酵母表达系统,并对其进行优化和筛选,以期获得高活性的重组犬α6干扰素（CaIFN-α6）。根据CaIFN-α6基因序列,按毕赤酵母菌密码子偏好性对CaIFN-α6全基因序列进行优化与合成,用Xho Ⅰ和Not Ⅰ双酶切将其连接至载体pPICZαA中,构建pPICZαA-CaIFN-α6重组表达质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取质粒pPICZαA-CaIFN-α6并线性化,电转入酵母感受态细胞X33中制备重组菌。采用甲醇进行诱导表达,收集上清,超滤浓缩,最终获得纯化的重组CaIFN-α6。利用BCA法测得纯化后的CaIFN-α6蛋白浓度为1.5 mg/mL,Western blotting分析表明CaIFN-α6蛋白具有良好的反应原性,SDS-PAGE显示其纯度约在95%以上,MDCK/VSV法检测其效价为2.37×10⁷ IU/mL,比活性为1.58×10⁷ IU/mg。结果表明犬α6干扰素在毕赤酵母pPICZαA表达载体系统中成功表达,且具有较高的生物活性,为后期的犬病毒病的临床预防与治疗提供了良好的支撑。     

3种检测牛白细胞源抗菌肽抗病毒活性方法的建立

为了建立牛白细胞源抗菌肽抗病毒活性的检测方法,采用半数组织细胞感染量(TCID₅₀)测定、荧光试验、MTT比色3种方法,用Vero ccl-81作为细胞模型,以猪水疱性口炎病毒(VSV)作为模式病毒,对牛白细胞源抗菌肽抗病毒活性进行评价。依据3种方法浓度水平测定的结果和由此结果推算出的抗病毒指标值建立回归模型,并对3种方法的稳定性进行试验。结果表明:抗菌肽浓度在0～62.5μg/mL时对Vero ccl-81细胞安全,在此浓度区间检测方法有效。在3种检测方法中,TCID₅₀法最准确,荧光试验特异直观迅速,MTT比色法准确又直观。TCID₅₀方法回归模型方程为:y=0.285x+1.890(R^2=0.928),荧光试验回归模型方程为:y=2.138x+6.136(R^2=0.903),CPE法回归模型方程为:y=10.229x+3.859(R^2=0.979),3种方法稳定性均较好。说明牛白细胞源抗菌肽基于TCID₅₀法、荧光试验、MTT比色法3种方法联合检测模型可以定量化地准确计算其抗病毒活性。     

Recombinant Expression of a Modified Shrimp Anti-Lipopolysaccharide Factor Gene in Pichia pastoris GS115 and Its Characteristic Analysis

Anti-lipopolysaccharide factors (ALFs) with a LPS-binding domain (LBD) are considered to have broad spectrum antimicrobial activities and certain antiviral properties in crustaceans. FcALF2 was one isoform of ALFs isolated from the Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis. Our previous study showed that a modified LBD domain (named LBDv) of FcALF2 exhibited a highly enhanced antimicrobial activity. In the present study, a modified FcALF2 gene (mFcALF2), in which the LBD was substituted by LBDv, was designed and synthesized. This gene was successfully expressed in yeast Pichia pastoris GS115 eukaryotic expression system, and the characteristics of the recombinant protein mFcALF2 were analyzed. mFcALF2 exhibited apparent antibacterial activities against Gram-negative bacteria, including Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, and Vibrio parahaemolyticus, and Gram-positive bacteria, including Bacillus licheniformis and Staphylococcus epidermidis. In addition, mFcALF2 could reduce the propagation of white spot syndrome virus (WSSV) in vivo by pre-incubation with virus. The present study paves the way for developing antimicrobial drugs in aquaculture.     

Physicochemical and Biological Characterization of Fucoidan from Fucus vesiculosus Purified by Dye Affinity Chromatography

A comparative study concerning the physicochemical, monomeric composition and biological characters among different fucoidan fractions is presented. Common purification techniques for fucoidan usually involve many steps. During these steps, the important structural features might be affected and consequently alter its biological activities. Three purified fractions were derived from Fucus vesiculosus water extract which, afterwards, were purified by a recently-developed dye affinity chromatography protocol. This protocol is based on dye-sulfated polysaccharide interactions. The first two fractions were obtained from crude precipitated fucoidan at different pH values of the adsorption phase: pH 1 and 6. This procedure resulted in fucoidan_1 and 6 fractions. The other, third, fraction: fucoidan_M, however, was obtained from a buffered crude extract at pH 1, eliminating the ethanol precipitation step. All of the three fractions were then further evaluated. Results revealed that fucoidan_M showed the highest sulfur content (S%), 12.11%, with the lowest average molecular weight, 48 kDa. Fucose, galactose, and uronic acid/glucose dimers were detected in all fractions, although, xylose was only detected in fucoidan_1 and 6. In a concentration of 10 µg·mL⁻¹, Fucoidan_6 showed the highest heparin-like anticoagulant activity and could prolong the APTT and TT significantly to 66.03 ± 2.93 and 75.36 ± 1.37 s, respectively. In addition, fucoidan_M demonstrated the highest potency against HSV-1 with an IC₅₀ of 2.41 µg·mL⁻¹. The technique proved to be a candidate for fucoidan purifaction from its crude extract removing the precipitation step from common purification protocols and produced different fucoidan qualities resulted from the different incubation conditions with the immobilized thiazine toluidine blue O dye.     

6种中药成分对猪传染性胃肠炎病毒的体外抑制作用

【目的】为探讨连翘苷等6种中药成分抗猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的作用机制,明确其体外抗病毒作用效果,为抗TGEV的药物筛选提供依据。【方法】利用动物细胞培养技术,采用MTT比色法和细胞病变(CPE)观察法相结合,测定连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚6种中药成分不同浓度下对猪睾丸细胞（ST）的毒性作用,通过观察细胞CPE情况,确定药物对细胞作用的最大安全浓度;同时测定病毒的TCID₅₀,用细胞维持液配成100·TCID₅₀病毒悬液备用;将6种药物在最大安全浓度范围内连续2倍倍比稀释后,分别采用先感染病毒后加药、先加药后感染病毒、药与病毒混合后感染细胞3种不同作用方式进行体外增殖抑制试验,各试验组均设置正常细胞对照组和病毒对照组,每组设置3个重复,通过酶标仪测得630 nm处OD值,计算出不同作用方式下中药成分分别对TGEV的抑制率,筛选出抗TGEV活性较好的中药成分,并分别记录抗病毒效果最佳时药物的浓度;6n>种中药成分与病毒作用后,测定TGEVRT-PCR鉴定各个药物单体对病毒RNA合成的抑制情况,进一步明确各中药成分对TGEV的抑制作用。【结果】连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚的最大安全浓度分别为320、200、80、125、100、200 μmol·L^-1;抗病毒效果最佳时药物的浓度分别为：160、100、20、62.5、25、100 μmol·L^-1。根据Karber法计算出初始TGEV的TCID₅₀为10^-6.25/0.1 mL;6种中药成分对TGEV在ST细胞上均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸浓度为62.5 μmol·L^-1时与100·TCID₅₀病毒混合作用后的病毒增殖抑制效果最好,相互作用72 h时,细胞形态依然能够保持圆滑、无固缩、完整,且细胞间轮廓清晰,仅有少量细胞脱落、死亡;此时测上清病毒的TCID₅₀为10^-3.75/0.1 mL,结果显示咖啡酸组病毒含量比病毒对照组10^-6.45/0.1 mL差异极显著（P＜0.01）;通过酶标仪测得630 nm处OD值计算出抑制率能够达到84.4%,咖啡酸直接灭活病毒作用极其显著。其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚,其病毒滴度分别为：10^-4.75、10^-5.55、10^-5.55、10^-5.65、10^-5.75/0.1 mL,但是这几种中药成分对病毒的抑制作用不够显著,抑制率大多在50%以下。另外,各中药成分对TGEV在ST细胞上的增殖抑制作用均为对TGEV的直接灭活作用最好,其次为对TGEV吸附阻断作用,最后为对TGEV的复制阻断作用。RT-PCR鉴定中药成分对病毒抑制作用,结果显示咖啡酸组条带与病毒对照组相比较暗,病毒效价较低,对病毒抑制作用效果显著;其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚。【结论】6种中药成分在ST细胞上对TGEV均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸直接灭活病毒作用最显著,有望被开发成抗病毒药物。     

犬IFN-α优化基因的真核表达及抗病毒活性的研究

本研究根据酵母系统密码子的偏嗜性,对成熟蛋白基因核苷酸序列进行密码子偏嗜性改造,利用毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC来表达犬IFN-α成熟蛋白基因。并采用非洲绿猴肾细胞(Vero) -水疱性口炎病毒(VSV)系统以细胞病变抑制法为基础来测定重组犬α干扰素的效价,同样方法测定了表达产物对PRV和CDV的抑制作用。本试验实现了犬α干扰素在酵母中的高表达,表达量高达58 mg/L,SDS-PAGE检测大小约为24 ku,比预测分子质量大,推测发生了糖基化。表达产物具有较强的种属特异性,在Vero细胞上对PRV具有较高的抗病毒活性,达到了3.6×10⁷ U/L,对CDV也有很好的抑制作用。本研究为犬IFN-α以后的临床应用研究奠定基础。     

鸡突变型和未突变型Mx蛋白体外抗病毒活性研究

【目的】研究鸡Mx蛋白第631位氨基酸变异与抗病性的相关性。【方法】用已经构建成功的中国狼山鸡Mx蛋白基因突变型pcDNA3.0-MMx和未突变型pcDNA3.0-Mx真核表达载体分别转染鸡成纤维（CEF）细胞和鼠成纤维（NIH-3T3）细胞;利用RT-PCR检测突变型MMx基因和未突变型Mx基因的表达,微量细胞病变抑制法测定重组蛋白抗新城疫病毒（NDV）和水泡性口炎病毒（VSV）的效果。【结果】诱变鸡Mx基因的表达重组蛋白可保护CEF细胞在孵育48 h内免受NDV的感染;转染突变型pcDNA3.0-MMx真核表达载体的NIH-3T3细胞在孵育60 h内亦未受到VSV的浸染;而转染未突变型pcDNA3.0-Mx真核表达载体的CEF和NIH-3T3细胞在24 h内均发生了病变。【结论】体外重组突变的Mx蛋白在单细胞水平上具有延缓NDV和VSV感染的能力。