猪β干扰素基因的修饰及其蛋白活性的检测

为获得高效表达的重组猪β干扰素,在保留编码蛋白序列的同时,对PoIFN-β基因进行毕赤酵母偏嗜性改造,使基因序列G+C的含量增加到最大限度,并将其终止密码子改为TAA.构建了酵母表达裁体pPICZαC-PIB.pPICZαC-PIB经Sac Ⅰ酶切线性化后电转导入毕赤酵母菌株X-33.对PCR鉴定为阳性的酵母菌株进行高抗性筛选,获得1株高效表达PoIFN-β酵母菌株,其表达量约258.3 mg/L,是未经密码子改造菌株表达产物的3.4倍.经SDS-PAGE和Western blotting检测,表达产物为相时分子质量约22 000和24 000的蛋白,两者均可与抗PoIFN-β阳性血清发生特异反应.将表达产物进行氨基酸测序,测得2段随机肽段与PoIFN-β的氨基酸序列完全一致.在VSV-Vero系统上检测重组PoIFN-β对水泡性口炎病毒在Vero细胞中增殖的抑制作用,其抗病毒活性为1.88×106IU/L,是未经密码子改造菌株表达产物抗病毒活性的5.6倍.用MTT法检测PoIFN-β对猪外周血淋巴细胞成熟的影响,结果表明.猪重组PoIFN-β能有效刺激淋巴细胞转化,具有良好的免疫学活性.     

重组犬α6干扰素的酵母表达及其抗病毒活性评价

试验旨在构建犬α6干扰素毕赤酵母表达系统,并对其进行优化和筛选,以期获得高活性的重组犬α6干扰素（CaIFN-α6）。根据CaIFN-α6基因序列,按毕赤酵母菌密码子偏好性对CaIFN-α6全基因序列进行优化与合成,用Xho Ⅰ和Not Ⅰ双酶切将其连接至载体pPICZαA中,构建pPICZαA-CaIFN-α6重组表达质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取质粒pPICZαA-CaIFN-α6并线性化,电转入酵母感受态细胞X33中制备重组菌。采用甲醇进行诱导表达,收集上清,超滤浓缩,最终获得纯化的重组CaIFN-α6。利用BCA法测得纯化后的CaIFN-α6蛋白浓度为1.5 mg/mL,Western blotting分析表明CaIFN-α6蛋白具有良好的反应原性,SDS-PAGE显示其纯度约在95%以上,MDCK/VSV法检测其效价为2.37×10⁷ IU/mL,比活性为1.58×10⁷ IU/mg。结果表明犬α6干扰素在毕赤酵母pPICZαA表达载体系统中成功表达,且具有较高的生物活性,为后期的犬病毒病的临床预防与治疗提供了良好的支撑。     

猪β-干扰素的基因改造表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

本研究根据GenBank上登录的猪β-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(mPoIFNβ),在保持原猪β-干扰素蛋白序列不变的基础上,对猪β-干扰素基因进行了毕赤酵母偏嗜性改造,并构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ。pPICZαC-PoIFNβ经SacⅠ酶切线性化后,电击转化导入感受态的毕赤酵母菌株X-33中,转化子经YPDS+Zeocin抗性平板筛选和PCR鉴定后获得多株阳性菌株。阳性酵母菌株经甲醇诱导分泌表达了重组PoIFNβ,其表达量约为127.9 mg/L。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,结果表明,表达产物为分子质量约25和28 ku的混合物,并且二者都可与PoIFNβ阳性血清结合。以细胞病变抑制法测定重组β-干扰素在BHK-21细胞上的抗水泡性口炎病毒活性为2.8×10³ IU/mL;对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上抗病毒活性达到1.6×10³ IU/mL。     

鸡IL-18成熟蛋白基因变构体毕赤酵母表达载体的构建及表达

为使鸡IL-18成熟蛋白基因在真核系统中高效表达,对其进行定点突变,将酵母低频密码子突变为偏嗜性密码子,构建了鸡IL-18成熟蛋白变构基因真核重组表达载体pPICZαA-MChIL18*,并将其转化入P.pastoris X-33.重组菌株X-33/pPICZαA-MChIL18*经甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE检测,结果在约23 000处有目的条带,与预期的相对分子质量一致,占总蛋白的45%,对其进行Western-blot检测,结果与兔抗鸡IL-18多克隆抗体发生特异性免疫反应.结果表明,鸡IL-18成熟蛋白变构基因在毕赤酵母中成功的进行了表达.     

重组猪干扰素α6在毕赤酵母中表达及其活性研究

为获得稳定表达重组猪α6干扰素的毕赤酵母。人工合成Po IFN-α6基因片段,连接至pPICZαA质粒,构建PoIFN-α6毕赤酵母表达质粒pPICZαA-PoIFNα6;经Sac I酶线性化后转化至毕赤酵母X33感受态细胞,筛选阳性克隆;优化毕赤酵母表达条件,并对表达产物进行了体外抗病毒活性测定。结果表明,成功构建了表达重组猪α6干扰素的毕赤酵母,以1%甲醇诱导72 h后,菌体上清SDS-PAGE可见20 kDa左右目的条带,Western blot检测为阳性;表达的重组猪干扰素α活性在PRRSV/Marc-145、VSV/MDBK、PRV/Vero、PEDV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK-15和TGEV/PK-15系统中均具有良好的抗病毒活性。说明PoIFN-α6在细胞上清中表达成功,并且在不同宿主细胞中均有抗病毒活性。     

猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

提取经 Con A诱导培养的猪外周血白细胞总 RNA,RT- PCR扩增出猪 IFN- γ基因并克隆到 p GEM- T- easy载体 ,测序结果表明 ,扩增片段为含有信号肽的猪 IFN-γ完整基因。亚克隆猪 IFN-γ成熟蛋白编码基因 ,并对其 5′段前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。通过引入 SD序列 ,成功构建了猪 IFN- γ原核双顺反子表达载体 p L CS-po IFN2 G,并实现了猪 IFN-γ在大肠杆菌中的高表达 ,约占菌体总蛋白的 5 6 .5 %。表达产物以包涵体形式存在 ,用含 7mol/L 盐酸胍的变性液溶解及含 0 .5 mol/L盐酸胍复性液复性处理 ,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后 ,细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪 IFN-γ具有较高干扰素活性     

猪β干扰素的基因改造及真核表达

本试验选择高表达密码子重新设计合成猪β干扰素成熟肽核苷酸,通过设计特异的引物,在毕赤酵母表达系统中表达PoIFN-β,获得分泌表达的高活性重组PoIFN-β,并采用非洲绿猴肾细胞(Vero)-水泡性口炎病毒(VSV)系统以细胞病变抑制法测定重组猪β干扰素的效价,为指导重组PoIFN-β的临床使用和研究其生物学功能提供基础。     

黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中的高效表达

为高效表达黑曲霉糖化酶基因,根据GenBank中糖化酶的氨基酸序列(登录号:AY652617),选用毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏嗜性,全基因合成新的cDNA序列。改造后的基因克隆到pGAPZαA质粒中,获得重组分泌型酵母表达质粒pGAPZαA-EC,经限制性内切酶Bln Ⅰ酶切线性化后,电击转化入毕赤酵母细胞X33内。经高浓度博莱霉素抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测结果显示,糖化酶基因与毕赤酵母染色体稳定结合。糖化酶蛋白获得分泌表达,SDS-PAGE分析其分子质量约为80 ku,其表达量约为180 mg/L。表达产物经Starch-PAGE活性染色,显示其具有酶学活性。     

犬TfR胞外区密码子的优化、真核表达及与犬细小病毒VP2蛋白结合

为制备大量具有天然活性的犬胞外区可溶性转铁蛋白受体(sTfR),本试验通过密码子优化提高sTfR在真核细胞中的表达水平.利用RT-PCR方法从犬肝脏中扩增sTfR编码基因,依据该基因编码的氨基酸序列,参照人偏爱的密码子,对该基因进行密码子优化并由公司合成.利用peDNA3.1-CD5质粒分别构建野生型和密码子优化的sTfR基因真核表达载体,经磷酸钙介导使其在HEK293T细胞中进行表达,利用Western-blotting鉴定表达产物,通过ELISA检测重组犬sTfR蛋白与犬细小病毒VP2蛋白的结合活性.结果显示本试验扩增的犬sTfR基因与GenBank该基因序列的同源性为100%;通过在HEK 293T细胞中进行瞬时表达,结果显示密码子优化可以明显提高sTfR基因在HEK 293T细胞中的表达水平,提高了75%.同时表达的sTfR蛋白能够与犬细小病毒VP2蛋白进行特异结合,表明表达的重组sTfR蛋白具有天然活性.     

犬瘟热病毒V蛋白的表达、鉴定及亚细胞定位

为研究犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV） V蛋白的功能,将CDV V基因片段与pGEX-6P-1载体连接,构建pGEX-6P-1-CDV-V重组表达质粒,通过原核表达系统表达了V蛋白,并将纯化的V蛋白免疫BALB/c小鼠,制备阳性血清。同时,将CDV V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-CDV-V重组表达质粒,经转染Vero细胞后,用激光共聚焦技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,成功表达了V蛋白,并制备了阳性血清。重组质粒pcDNA3.1-CDV-V在外源真核细胞Vero中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。本试验结果为进行CDV V蛋白的功能研究奠定了基础。     

犬α干扰素的克隆、表达及纯化

根据DDBJ/GenBank基因库中已登录的犬α干扰素序列,设计了含SphⅠ和HindⅢ酶切位点的一对引物,采取聚合酶链式反应(PCR)技术以犬基因组DNA为模板进行了CaIFN-α的成熟肽基因的克隆,扩增产物与克隆载体pGEM-T Easy Vector连接后转入大肠杆菌JM109,经PCR鉴定和EcoRⅠ酶切鉴定,初步证实为CaIFN-α,用SphⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒,将目的片段与表达载体pQE30连接,然后转入大肠杆菌JM109,经PCR鉴定、SphⅠ和HindⅢ双酶切鉴定、序列测定证实已经成功克隆了CaIFN-α,构建了重组表达质粒PQE30/CaIFN-α。将重组表达菌液培养至OD600为0.5时加入IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析CaIFN-α在大肠杆菌中得到了表达,表达的目的蛋白以包涵体形式存在,表达量约占细菌总量的20%左右。将诱导表达的菌液经超声裂解、变性、复性、透析后,得较纯的CaIFN-α蛋白。本研究为以后CaIFN-α的活性及临床应用研究奠定了基础。     

Antiviral activity of rChIFN-α against vesicular stomatitis virus and Newcastle disease virus: A novel recombinant chicken interferon-α showed high antiviral activity

The sequences of 27 chicken interferon-alpha (ChIFN-α) genes were obtained from GenBank. The gene sequences were compared and homology between them was determined by using a bio-software. On the basis of these results, a new rChIFN-α peptide sequence with 194 amino acids was assembled. Thereafter, on the basis of the new amino acid sequences and by using the most frequently occurring codes of Pichia pastoris, and a 582 bp gene sequence was formed. In order to amplify this non-templated gene, 16 primers were designed, and their gene sequences were synthesized, and amplified. This amplified gene sequence was cloned into the expression vector pPICZα-A to construct a recombination plasmid named pPICZ-rChIFN-α. Then, the recombination plasmid was induced to express the rChIFN-α protein. The results demonstrated that the recombinant plasmid pPICZ-rChIFN-α was successfully expressed in P. pastoris. Furthermore, rChIFN-α had a considerable antiviral activity against both Newcastle disease virus (NDV) and vesicular stomatitis virus (VSV). Therefore, this method of gene engineering could give direction to research on the key amino acids in the interferon or analogous proteins and enable the construction of proteins with high antiviral activity, which can be used both for research and industrial purposes.     

Antiviral activity of rChIFN-α against vesicular stomatitis virus and Newcastle disease virus: a novel recombinant chicken interferon-α showed high antiviral activity

The sequences of 27 chicken interferon-alpha (ChIFN-α) genes were obtained from GenBank. The gene sequences were compared and homology between them was determined by using a bio-software. On the basis of these results, a new rChIFN-α peptide sequence with 194 amino acids was assembled. Thereafter, on the basis of the new amino acid sequences and by using the most frequently occurring codes of Pichia pastoris, and a 582 bp gene sequence was formed. In order to amplify this non-templated gene, 16 primers were designed, and their gene sequences were synthesized, and amplified. This amplified gene sequence was cloned into the expression vector pPICZα-A to construct a recombination plasmid named pPICZ-rChIFN-α. Then, the recombination plasmid was induced to express the rChIFN-α protein. The results demonstrated that the recombinant plasmid pPICZ-rChIFN-α was successfully expressed in P. pastoris. Furthermore, rChIFN-α had a considerable antiviral activity against both Newcastle disease virus (NDV) and vesicular stomatitis virus (VSV). Therefore, this method of gene engineering could give direction to research on the key amino acids in the interferon or analogous proteins and enable the construction of proteins with high antiviral activity, which can be used both for research and industrial purposes.     

猪Ⅰ型干扰素融合表达及其抗病毒活性检测

采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术将猪I型干扰素PoIFN-α和PoIFN-β成熟肽基因进行连接,构建表达载体pET30a-PoIFN-α/β进行融合表达,利用细胞病变抑制试验检测融合干扰素rPoIFN-α/β抗病毒活性,并与非融合干扰素rPoIFN-α和rPoIFN-β进行比较分析。结果表明,在PK-15细胞上,融合干扰素rPoIFN-α/β表现出较强的抗病毒活性,其对VSV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PASTV、PEDV和TGEV的抗病毒活性明显高于非融合干扰素,体现了一定的叠加效应,可以用于猪病毒性疾病的防治。     

鸡IL-18酵母表达载体的构建及表达条件的优化

应用PCR技术从含有罗曼鸡白介素18全长基因质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建了重组质粒pPICZαA-ChIL-18。经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达,并进一步分析了培养液pH值、诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对重组菌表达水平的影响,从而获得最优化的表达条件。结果表明,重组毕赤酵母菌能够表达鸡IL-18,且在培养液pH6.0,甲醇诱导浓度1.5%,诱导温度26℃的条件下诱导96 h,目的蛋白的表达量最高,可占菌体总蛋白的60.2%。本文为鸡IL-18的规模化发酵生产奠定了基础。     

荣昌猪IFN-ω基因毕赤酵母表达载体的构建与表达

将荣昌猪IFN-ω基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后,氯化锂法转化毕赤酵母菌株X-33,通过酶切、PCR鉴定表明成功构建了表达荣昌猪IFN-ω基因的酵母基因工程菌。经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测,表明荣昌猪IFN-ω基因在毕赤酵母中实现了高效表达。表达产物在MDBK细胞上抗VSV的比活性为1.21×106U/mg,表明具有抗病毒活性。     

基于GEM展示技术内含肽介导的犬α干扰素快速纯化系统的建立

本研究分别构建含有断裂型内含肽(inteins)C端与犬α干扰素融合基因(C*-CaIFN-α)、断裂型内含肽N端与锚钩蛋白(protein anchor,PA)融合基因(NC1A-PA3)的重组表达质粒,利用IPTG诱导表达。通过GEM颗粒(gam-positive baterial enhancermatrixparticles)与PA3之间的特异性结合,将NC1A-PA3蛋白捕获到GEM颗粒上,再利用内含肽的N端与C端的结合,获得GEM-PA3-NC1A-C*-CaIFN-α。在DTT或EDTA存在情况下,内含肽C末端自我剪切,获得纯化的犬α干扰素重组蛋白CaIFN-α。通过微量细胞病变抑制方法测定CaIFN-α蛋白的活性。结果表明,两种重组蛋白均有可溶形式表达,GEM/inteins纯化系统效果良好;纯化的犬α干扰素CaIFN-α对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的抗病毒活性为3.0×106U/mL。本研究建立的基于GEM展示平台的蛋白纯化系统,将非层析标签与断裂内含肽系统相结合,为快速有效地纯化重组蛋白提供了一种方法。     

绵羊生殖道抗菌肽cDNA克隆及真核表达载体构建

绵羊生殖道抗菌肽（ORTAP40）是从中国美利奴绵羊生殖道分离的一种新型的阳离子抗菌肽,在绵羊发育早期的防御中起到了主要的作用。在本研究中,根据ORTAP40 N端氨基酸序列设计引物,利用3′RACE技术克隆了绵羊生殖道抗菌肽3′末端全长cDNA序列,并被GenBank收录,登录号为FJ514476,经过cDNA序列分析显示,ORTAP40是一个4.8 ku的小肽,与先期分离纯化的分子质量一致。作者随后参照巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子偏好性,设计并人工合成了ORTAP40成熟肽目的基因片段,所合成的ORTAP40基因全长120 bp,通过基因重组的方法将目的基因克隆到pPIC3.5K和pPICZαA表达载体上,成功构建了重组酵母胞内表达载体pPIC3.5K-ORTAP40和外泌表达载体pPICZαA-ORTAP40,为抗菌肽的开发和应用奠定了基础。     

犬干扰素α制备工艺的优化

根据Genbank的犬干扰素仪序列,经密码子优化后,设计并合成了编码CalFN-仪蛋白的基因片段。CaIFN-0l基因与pBV220温度诱导表达载体连接,转化大肠杆菌BL21。经培养、升温诱导表达,目的蛋白以包涵体的形式存在,蛋白分子量约为18000,蛋白表达量为25％。菌体经超声破碎、变性、复性后,目的蛋白纯度为69％,收率为28％;疏水层析后,目的蛋白纯度87％,收率为81％;分子筛层析后,目的蛋白纯度为96％,收率为90％。纯化的CalFN-o蛋白的生物学比活性为3×10’IU／mg,内毒素≤10EU／mg,符合兽用药要求。此制备工艺总产率高达20％、重现性好,适用于大规模生产。