共表达NDV F和IBDV VPO基因重组鸡痘病毒遗传稳定性研究

将共表达NDV F和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒(重组鸡痘病毒vFV282)接种10日龄～11日龄SPF鸡胚,连续传10代,分别对第5、8、10代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定;重组鸡痘病毒vFV282接种鸡胚成纤维细胞,分别对第1、5、10、15、20、25、30代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定;重组鸡痘病毒vFV282翅翼刺种于鸡体上,连续传8代,对第3、5、8代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定.结果表明,重组鸡痘病毒vFV282在SPF鸡胚上传10代、在SPF鸡胚成纤维细胞传30代、在鸡体传8代后,其毒力未返强,F基因和VP0基因未发生缺失和变异.     

共表达NDVF和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒遗传稳定性研究

将共表达NDVF和IBDVVP0基因重组鸡痘病毒（重组鸡痘病毒vFV282）接种10日龄～11日龄SPF鸡胚，连续传10代，分别对第5、8、10代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定；重组鸡痘病毒vFV282接种鸡胚成纤维细胞，分别对第1、5、10、15、20、25、30代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定；重组鸡痘病毒vFV282翅翼刺种于鸡体上，连续传8代，对第3、5、8代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定。结果表明，重组鸡痘病毒vFV282在SPF鸡胚上传10代、在SPF鸡胚成纤维细胞传30代、在鸡体传8代后，其毒力未返强，F基因和VP0基因未发生缺失和变异。     

表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性

本实验为了评价表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒（rFPV282E4-SF，rFPV Lp-SF）的遗传稳定性，将其在鸡胚成纤维细胞连续培养20代。通过蓝斑来鉴定重组鸡痘病毒纯度，结果所有蚀斑100％变蓝。通过对第0、10和20代F基因扩增并进行序列测定，所有碱基和氨基酸序列均和原始转移载体序列完全一致，没有发生任何改变。随后又通过间接免疫荧光证实rFPV282E4-FS和rFPV LP-FS各个代次F基因的特异表达。所有结果均显示了上述重组鸡痘病毒：艮有良好的遗传稳定性，满足兽医生物制品的遗传稳定性要求。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP3基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDV Gx株进行培育，通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱，对其结构蛋白VP3基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析，从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律。对不同代次细胞毒序列分析的结果表明，细胞毒在第8代以前，VP3基因序列没有改变，与标准超强毒HK46株氨基酸同源性达99％以上；细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变；10代毒VP3基因与标准弱毒P2株氨基酸序列同源性达100％；细胞适应毒传至20代，其VP3基因序列不再改变。从而说明，vvIBDV Gx株在致弱过程中，VP3基因也随之改变。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP5基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)Gx株进行培育,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱,对其非结构蛋白VP5基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析,从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律.对不同代次细胞毒序列分析的结果表明,细胞毒在第8代以前,VP5基因序列没有改变,与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达98%以上;细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变;10代毒VP5基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达99%;细胞适应毒传至20代,其VP5基因序列不再改变.从而说明,vvIBDV Gx株VP5基因在致弱过程中存在变化规律.     

表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的筛选

将转移载体P11SF和PN11SF分别与282E4株鸡痘病毒（282E4 strain fowlpox virus，282E4FPV）和大空斑株鸡疽病毒（large plaque strain fowlpox virus，LP FPV）共转染鸡胚成纤维细胞，通过蓝斑筛选，得到4株重组鸡痘病毒rFPV282E4-SFA、rFPVLP，-SFA、rFPV282E4-SFB和rFPVLP-SFB，通过PCR和间接免疫荧光鉴定均为阳性，另外将各重组病毒分别传20代，测其遗传稳定性，结果显示均具有良好的稳定性。对SPF鸡进行免疫效力试验，攻毒后均100％保护，而对于商品鸡，保护率分别为64％、60％、52％和88％。     

共表达新城疫病毒F基因、传染性法氏囊病病毒VP0基因的重组鸡痘病毒的抗原性和免疫原性

以鸡痘病毒(FPV)282E4株TK基因为侧翼,将2个相同的复合启动子ATI@p7.5×20以反向方式连接,分别调控新城疫病毒(NDV)F基因和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP0基因,得到重组转移质粒pVP0-2ATI@p7.5×20F.然后将该重组转移质粒用脂质体转染预先感染FPV 282E4株的鸡胚成纤维细胞(CEF),在经BrdU(5-溴-脱氧尿嘧啶)加压处理后的CEF上传代,用间接免疫荧光试验、Western blot检测,有2株鸡痘病毒能同时表达NDV F蛋白和IBDV VP0蛋白.用这2株重组鸡痘病毒刺种商品Leghorn雏鸡,于刺种前及刺种后1、2、3周对抗NDV特异性抗体水平和淋巴细胞转化能力检测,结果发现,重组鸡痘病毒能激发机体产生良好的免疫反应.结果表明,重组鸡痘病毒可以作为疫苗备选株进行研究与开发.     

表达鸡马立克氏病病毒gB基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性及生物安全性评价

为了评价表达鸡马立克氏病病毒gB基因重组鸡痘病毒(rFPV-gB/R)的遗传稳定性,我们将纯化后的重组病毒在CEF单层上连续传30代,引起细胞病变的速度和形态均未发生明显变化;覆盖含X-Gal的琼脂引起的空斑均为蓝色;间接免疫荧光实验证明rFPV-gB/R中的gB基因始终能稳定表达;序列测定结果表明,重组病毒在细胞上连续传30代、在SPF鸡上连续传5代后,gB基因序列没有发生任何变化;以0、10、20、30代重组病毒制成冻干疫苗进行的实验室免疫效力实验表明,细胞连续传代后rFPV-gB/R仍然保持了原有的免疫原性。可见重组鸡痘病毒gB基因的结构和免疫原性都是高度稳定的。为了评价rFPV-gB/R的生物安全性,我们将rFPV-gB/R通过SPF鸡连续传5代,检测病毒在鸡体的存在部位及其消长、生长繁殖性能和毒力变化;将rFPV-gB/R免疫鸡与未免疫鸡同笼饲养,攻击FPV-102E6强毒,以检测rFPV-gB/R感染鸡的接触传染性。结果显示,rFPV-gB/R在鸡体的存在时间大约为7d,在体内仅存在于接种部位;鸡体传代后痘病毒毒力有一定程度下降,gB基因核苷酸序列未发生任何变化;同居未免疫SPF鸡在痘病毒强毒攻击后全部发痘,可见重组病毒免疫鸡没有接触传染性,能在鸡体内稳定地传代,rFPV-gB/R具有高度的生物安全性。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株的致弱研究

本研究成功将鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDVGx株通过SPF鸡胚的快速培育及鸡胚成纤维细胞传代致弱，揭示了vvIBDV从超强毒力向弱毒力转化过程中，其主要结构蛋白VP2基因核苷酸及推导的氨基酸序列的变化规律。对不同代次细胞毒进行了序列分析。发现细胞毒在第7代以前，VP2基因序列没有改变。与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达100%；细胞毒第8代，有个别核苷酸发生了改变。但没有影响氨基酸序列；细胞毒第9代是变化复杂的过渡代；10代毒VP2基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达97%；以后的细胞适应毒至20代。其VP2基因序列不再改变。致病性实验表明原代毒对4周龄SPF鸡致死率为64%。细胞毒第5代的致死率为60%，而20代毒对鸡无致病性。在鸡体内连续传代6代不返强。     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性评价

为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因重组鸡痘病毒（rFPV-ILTVgB)的稳定性，我们对重组病毒进行6代和16代克隆纯化，对纯化后的病毒通过转瓶连续培养传20代，结果发现第6代纯化病毒（rFPV-ILTVgB-C6)在传代过程中有白斑出现，说明病毒纯度不够；经过16代纯化的病毒（rFPV-ILTVgB-C16)对细胞的嗜性加强，病毒的效价进一步升高，20代传代后蓝斑率仍然为100％，PCR的检测进一步证明插入的外源基因能在病毒的长期传代过程中稳定地遗传。抽取病毒细胞传代过程中的第5，10，15，20代次的病毒翅膀内侧无血管处皮下接种2周龄SPF鸡，20天后分为两组，分别用传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒102株攻击，结果不同代次的重组病毒均可以使免疫鸡抵抗传染性喉气管炎病毒和鸡痘病毒强毒的攻击，鸡体内病毒传代试验表明，重组病毒在接种部位仅存在6天，之后就检测不到病毒，重组病毒通过SPF鸡连续传代，不存在病毒返祖的可能，由此可以得出一个结论：rFPV-ILTVgB在结构上和免疫原性上是稳定的，无论是在体外传代，还是在体内均可以稳定遗传，不存在因为接种重组疫苗而给免疫鸡群带来安全威胁的可能，完全可以作为疫苗毒株进行商品化开发。     

超强毒IBDV GX8/99株不同传代毒致病性与VP5基因的关系分析

将vvIBDV GX8/99株原代毒、鸡胚毒、克隆化毒、回传SPF鸡10代次毒及克隆化细胞传20代次毒分别测定ELD50,以相同的ELD50病毒量分别接种SPF鸡,从而观察vvIBDV GX8/99株在传代过程中致病性的变化规律。同时分别提取病毒RNA,通过RT-PCR、PCR扩增、基因克隆、核苷酸序列测定和分析,对IBDV GX8/99株的24株不同传代毒的VP5基因进行比较,发现其同源性在94%～100%,并且有15个易发生变异的位点,其中位点bp#2、#8、#52、#145、#232、#272、#310、#364、#385、#409的碱基变异引起了相应氨基酸的改变,而位点bp#18、#285、#331、#354、#397的碱基变异没有引起相应氨基酸的变化。通过比较分析,可以看到在致死率由原代毒的86.7%降为GXE10的43.0%时VP5基因的核苷酸有4个位点发生了变异,致死率由GXE10的43.0%降为GXC23的3.3%时VP5基因的核苷酸有10个位点发生了变异;而将GXC23克隆化后的4株毒株致病性变化不大,并且仅在GXCL1-1的#8位点,GXCL2-1和GXCL4-1的#364位点发生变异;将4株克隆化毒株回鸡传10代后的致死率有一定程度的回升,且有2个位点发生变异;4株克隆化毒株在细胞上连续传20代后其致死率都降为0.0%,并且克隆株5没有发生核苷酸变异而克隆株1,2,4也仅有1个核苷酸位点发生变异。由此推论vvIBDVGX 8/99株的致病性与VP5基因某些氨基酸的变异有一定的关系,更可能与病毒对细胞的亲嗜性关系密切;这为探明vvIBDV毒力改变的分子基础,从而解释自然界中vvIBDV出现和致弱的原因提供了佐证。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒云南株的分离鉴定及其ORF5基因遗传特性分析

用Marc145细胞从云南某猪场分离到两株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),将其命名为YN-1和YN-2。分离株在Marc145细胞上盲传4代后出现明显的细胞病变,其滴度为10^-3.6/0.1 mL。PCR方法对NSP2基因进行扩增结果表明,分离株缺失了90个核苷酸缺失,NSP2基因符合强毒特征。对分离株ORF5基因序列进行扩增和测序,进行同源性及遗传特性分析,结果表明,分离到的两株PRRSV位于进化树的同一个小分支上,其核苷酸同源性为99.5%,与山东株JN-HS、河南株Henan-1及越南株347-T-KSA位于同一个小分支上,其遗传距离较近,核苷酸同源性高达99.2%~99.8%,与国内经典毒株Ch-1a和VR-2332的核苷酸同源性仅为94.4%~94.5%,与国内其它强毒株的核苷酸同源性高达98%~99%,均属于强毒株。     

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。     

重组鸡痘病毒vFV282活疫苗最小免疫剂量及攻毒保护试验

将重组鸡痘病毒vFV282疫苗用生理盐水作10^-1，10^-2，10^-3，10^-4系列稀释，分别免疫7天龄鸡，于免疫后21d，分别用NDV、IBDV和FPV攻毒，观察其保护率，结果除NDV攻毒在10^-4组保护率为40％（4／10），其余各组均为100％（10／10）保护。表明该疫苗的最小免疫剂量≤10^-3TCID50/0.02mL。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒的遗传稳定性分析及滴度测定

研究表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒pAd-H5的遗传稳定性及重组病毒的滴度。将重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15和20代的重组病毒采用PCR方法扩增禽流感病毒HA基因,并进行基因序列分析;用标记为GFP的快速测定法计算出20代次时重组病毒的滴度。从各代重组病毒DNA中均扩增出了约1700bp的目的条带,与HA基因片段长度一致。基因序列分析表明:第5、10、15代重组病毒中的HA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有1处发生了点突变(即HA基因417位A→G),但其编码的氨基酸未发生变化(即同义突变),表明表达的目的蛋白抗原表位未发生变化;计算出的重组病毒滴度为108.875pfu/0.1mL。重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,具有良好的遗传稳定性,重组腺病毒的病毒滴度相对较高。     

鸡痘病毒基因探针检测方法的建立及初步应用

利用PCR方法成功克隆了鸡痘病毒（Fowl poxvirus，FPV）4b核心蛋白基因549bp片段，序列分析表明，该序列与模板DNA（AF198100）碱基序列的同源性为99．45％，只有3个碱基差异，第215位由C→T，第386位由T→A，第388位由G→A。回收FPV4b核心蛋白基因549bp片段，以其为模板制备了地高辛标记的DNA探针。对新标记的探针进行标记效率检测，结果显示其标记效率为100mg／L；敏感性检测表明，该探针对同源DNA的检出限量为10Pg；特异性检测结果表明，用本试验所标记的探针对提取的FPV282E4和FPV儿株DNA、重组质粒pMD 18-T-4b进行检测结果均呈阳性，而鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、CEF的核酸提取物均成阴性，说明该探针具有较强的特异性。初步应用表明，本试验所建立的FPV的基因探针检测法可用于FPV的检测。     

共表达与牛疱疹病毒1型VP22融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒E及M蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其免疫原性观察

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因工程疫苗，以伪狂犬病毒（PRV）gE基因缺失标志疫苗株TK^-／gE^-／LacZ^＋为病毒载体，通过同源重组，构建了共表达与牛疱疹病毒1型VP22（BHV-1 VP22）融合的PRRSV E及M蛋白的重组伪狂犬病毒（rPRV）TK^-／gE^-／VP22E^＋／VP22M^＋。经PCR、Southern blot、Western blot证实rPRV构建正确，并能表达与BHV-1 VP22融合的PRRSV E及M蛋白。rPRV在IBRS-2、PK-15细胞中的增殖滴度与PRV亲本株相比无显著差异，表明外源基因的插入不影响rPRV增殖。用该rPRV免疫BALB／c小鼠,检测免疫小鼠抗PRRSV中和抗体及脾淋巴细胞增殖反应，并与未融合VP22的单表达PRRSV E蛋白及共表达E及M蛋白的rPRV TK^-／gE^-／E^＋与TK^-／gE^-／E^＋／M^＋进行比较。结果显示TK^-／gE^-／VP22E^＋／VP22M^＋可诱导小鼠产生更好的体液与细胞免疫反应，BHV-1 VP22发挥了佐剂效应。本研究为研制安全、有效的猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了基础。     

1型鸭甲肝病毒LY0801株VP1基因在鸭胚传代中的变异规律研究

为了解1型鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus type 1）VP1基因在鸭胚传代中的变异规律,本研究将LY0801株DHAV-1在鸭胚体内传代至30代,分别对1~5、10、15、20、25、30代病毒进行VP1基因的克隆测序。各代次病毒分别以108copies/胚接种9日龄健康鸭胚,测定各组鸭胚的平均死亡时间和病毒在鸭胚尿囊液中的增殖拷贝数。结果表明：DHAV-1在鸭胚传代过程中,不同代次之间出现12个氨基酸的反复变异和同步变异,分别为R43M（K）、T48A、T101S、L169F、T180I、S181L、R183Q、E184A（K）、G187D、D193N、M213R、H219Y;在传代过程中,病毒致死鸭胚的时间逐渐延迟,但病毒在鸭胚内的增殖拷贝数未呈现稳定增长的趋势。