猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得到3条与试验设计相符的1 060bp(TGEV)、462bp(PEDV)及258bp(PBoV)特异性条带,建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法。结果表明,在同一PCR反应体系中,可以同时检测这3种病毒核酸片段,而对其他病毒的检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法的最低检测限分别为35、20、10pg的核酸。采用该方法对60份临床样品进行检测,TEGV阳性率为1.6%,PEDV阳性率为6.7%,PBoV阳性率为21.7%,表明建立的方法可以应用于临床检测。     

应用多重RT-PCR方法检测158例猪粪样中的两种冠状病毒

根据GenBank上发表的猪流行性腹泻（PEDV）和猪传染性胃肠炎（TGEV）基因序列，针对其PEDVM（膜蛋白）基因保守区及TGEV的S基因（纤突蛋白基因）5’端保守区，各设计一对引物，可特异扩增出目的条带大小分别为467bp和1062bp。用上述两对引物对同一样品中的PEDV和TGEV可进行鉴别检测，对猪的其它病毒和细菌的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明：该双重PCR方法能检出PEDV1pg、TGEV0．1pg的模板。同时采用建立的多重RT-PCR及韩国引进的PEDV和TGEV病毒抗原快速诊断试剂盒检测结果显示：此多重RT-PCR方法特异性强，且较快速试剂盒更加敏感。应用多重RT-PCR对158份临床猪粪样的检测结果表明：我国很多猪场普遍存在TGEV和PEDV，尤其以PEDV污染更为严重，感染率达53．2％，但双重感染率较低，仅为4，4％。     

巢式RT-PCR在猪传染性胃肠炎病毒检测中的应用

建立对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的巢式RT-PCR(RT-nested PCR)检测方法,为该病的诊断和流行病学调查提供更为可靠和敏感的手段。根据GenBank中收录的TGEV,纤突蛋白S基因的核酸序列设计了2对引物,以mRNA为模板,通过RT-PCR、RT-nested PCR方法,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了快速检测TGEV的RT-nested PCR诊断方法。试验结果成功扩增出长度为886 bp和690 bp的TGEV目的片段,但未扩增出猪传染性腹泻病毒(PEDV)片段。表明RT-nested PCR方法可用于检测猪传染性胃肠炎病毒,而且此法简单省时、灵敏性高。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,针对TGEVN基因全序列设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株为模板,建立了检测TGEV的RT-PCR方法。应用该方法对TGEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1168bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGEV不同毒株的序列同源性达到95%～97%;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的TGEV-N-cDNA;对猪传染性胃肠炎(TGE)的病料进行RT-PCR鉴定,可检测出TGEVN基因片段。结果表明建立的RT-PCR方法对TGEV的检测敏感性高、特异性强,可用于TGEV感染的诊断和流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎与流行性腹泻病毒二重RT-PCR 检测方法的建立及应用

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的TGEV核蛋白(N)基因和PEDV膜蛋白(M)基因保守区域序列分别设计了1对特异性引物,以TGEV和PEDV混合总RNA为反转录模板,建立了TGEV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了应用检测,并对检测到的阳性样品进行克隆测序。结果表明,成功建立了TGEV和PEDV二重RT-PCR检测方法,该方法的检测灵敏度最低极限为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增TGEV和PEDV细胞培养物,但对ST细胞和其他7种病原对照扩增不出任何条带;对22份临床疑似TGEV和PEDV感染样品检测结果与测序结果完全一致。本研究成功建立了TGEV与PEDV二重RT-PCR检测方法,可适用于猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病的快速鉴别诊断。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,针对TGEV N基因全序列设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株为模板,建立了检测TGEV的RT-PCR方法.应用该方法对TGEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1 168 bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGEV不同毒株序列的同源性为95%～97%;敏感性测定结果为可扩增到18 pg的TGEV N基因cDNA.结果表明,建立的RT-PCR方法对TGEV的检测敏感性高、特异性强,可用于TGEV感染的诊断和流行病学调查.     

一步法多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒方法的建立和应用

根椐Gen Bank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PARV)基因序列,分别设计3对引物,在建立各病毒单项一步法RT-PCR技术的基础上,优化多重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的一步法多重RT-PCR检测方法,用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV和PARV核酸模板进行多重RT-PCR扩增,结果可同时扩增PEDV的450 bp、TGEV的609 bp、PARV的241 bp特异性片段,而对其它4种病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR技术能检出10 pg的PEDV、10 pg的TGEV和1 pg的PARV模板。用67份临床病料对建立的多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

猪主要腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)N基因的序列，分别设计相应的引物，构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品，通过优化反应条件和反应程序，建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示，该方法具有较高的灵敏性，对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×10²,1.44×10²,1.51×10²和1.56×10²拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)、猪瘟病...     

猪传染性胃肠炎病毒NASBA检测方法的建立

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)NASBA的检测方法,本研究利用BioEdit和BlastN,根据GenBank中猪TGEV的S基因保守序列设计引物,建立了扩增TGEV的NASBA检测技术。利用该方法建立的反应体系在41℃反应2h即可得到有效扩增。实验结果表明:该方法对TGEV进行扩增获得约200bp特异性目的条带,而对CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、PEDV和ST细胞扩增结果均为阴性。NASBA的灵敏度高于普通RT-PCR,与病毒分离方法相当,可检测到5pg的核酸。该方法为TGEV的早期诊断提供了新途径。     

猪流行性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用简

为建立一种快速、敏感的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）检测方法,试验据GenBank中PEDV基因组序列,设计并合成针对M基因的内、外2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测PEDV的巢式RT-PCR方法。结果显示,单一使用外引物或内引物进行常规RT-PCR时检测限量均为50 pg PEDV RNA模板,而使用巢式RT-PCR可检测到50 fg PEDV RNA模板。使用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。结果表明,建立的巢式RT-PCR方法特异性、敏感性好,可快速准确地检测出样本中微量PEDV核酸。     

应用多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒和桃拉病毒

研究建立了一种可同时检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)和桃拉病毒(TSV)的多重聚合酶链式反应(多重PCR)技术。根据WSSV和TSV基因序列，设计合成了2对分别与WSSV和TSV某段基因序列互补的引物，用这2对引物对同一样品中的WSSV DNA和TSV RNA模板进行多重PCR扩增。结果均同时得到了2条特异的与实验设计相符的306bp(WSSV)和231bp(TSV)多重PCR扩增带，而对其他对虾病病原的PCR扩增结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR技术能检出10pg的WSSV DNA和1pg的TSV RNA模板。     

应用多重反转录-聚合酶链反应检测鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的研究

本文建立了一种同时检测NDV和IBV二种病原体的多重PCR技术。根据NDV和IBV的基因文库 ,设计了两对分别与NDV和IBV某段基因序列互补的引物 ,用这两对引物对同一样品中NDV和IBVRNA模板进行多重RT_PCR扩增 ,结果均同时得到了两条特异性的大小与实验设计相符的 31 0bp(NDV)和 1 72 0bp(IBV)多重的RT_PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果表明 ,该多重RT_PCR技术能同时检出 1 0pg的NDV和 1 0 0pg的IBVRNA模板。     

应用多重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡新需疫病毒,鸡传染性支气管炎病毒,鸡

本文建立了一种同时检测ＤＮＶ、ＩＢＶ、和ＭＧ４种病原体的多重ＰＣＲ技术。根据ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ和ＭＧ的基因文库,设计了４对分别与ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ和ＭＧ某段基因序列互补的引物,用这４对引物对同一样品中的ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ、ＭＧＲＶＡ和ＤＮＡ模板进行多重ＰＣＲ扩增,结果均同时得到了４条特异性大小与实验设计相符的３１０ｂｐ（ＮＤＶ）、１７２０ｂｐ（ＩＢＶ）、６４７ｂｐ（ＩＬＴＶ）和７３２ｂｐ（ＭＧ）多重ＰＣＲ扩增带,而对其他６种禽病病原的ＰＣＲ扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重ＰＣＲ技术难检出１０ｐｇ的ＩＢＶ、１ｂｇ的ＮＤＶ ＲＮＡ模板和ＩＬＴＶ、１ｐｇ的ＭＧ ＤＮＡ模板。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与变异株RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用

本试验旨在建立一种快速的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)经典株和变异株的鉴别诊断方法。根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)经典株与变异株Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别诊断PRRSV经典株和变异株的RT-PCR检测方法;该方法能从经典株与高致病性株PRRSV基因组中分别扩增出549和459 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性;该方法能分别检测出1 pg经典株和0.1 pg变异株RNA含量。建立的RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确、快速鉴别出PRRSV经典株与变异株,将为猪繁殖与呼吸综合征病毒的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的鉴别诊断方法。     

多重PCR技术同时检测牛传染性鼻气管炎和赤羽病方法的建立和应用

为满足同时对IBRV和AKAV进行快速诊断的需要,根据牛疱疹病毒1型(BHV 1)gB基因序列和赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了2对针对这2种病毒的特异引物,并建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:该方法能同时扩增得到2条与试验设计相符的311 bp(I BRV)和392 bp(AKAV)特异性条带;IBRV的灵敏度为0.13 pg/25μL,AKAV的灵敏度为1.04 pg/25μL。本试验方法的建立对于加强进出口牛IBRV和AKAV的检验检疫具有十分重要的意义。     

PEDV、TGEV、PoRV和PKV多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV),根据PEDV的M基因、TGEV的N基因、PoRV的VP6基因和PKV的3D基因序列设计4对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测4种病毒的RT-PCR诊断方法,该方法可特异性扩增这4种病毒的相应片段,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)均无扩增,最低检出量分别为1.33×10^4、1.33×10^3、1.33×10^4、1.33×10^5copies/μL。应用该方法对临床55份猪腹泻样品进行检测,结果检测出14份PEDV、1份PoRV和27份PKV,未检出TGEV,其中PEDV和PKV混合感染9份。上述结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于以上4种腹泻病毒的临床检测和流行病学调查。