应用RT—nested PCR检测猪流行性腹泻病毒的研究

将猪流行性腹泻病毒分离株HLJ02，经过胰酶处理后，在Vero细胞上增殖。利用Gen-Bank中的基因序列设计合成了2对M基因引物。应用RT-PCR和RT-nested PCR检测分别扩增出HLJ02的854bp的M全基因片段和412bp的M基因部分片段，而在猪传染性胃肠炎病毒中和Vero培养液中未扩增出上述产物。结果表明，RT-nested PCR检测可用于检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,针对TGEVN基因全序列设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株为模板,建立了检测TGEV的RT-PCR方法。应用该方法对TGEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1168bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGEV不同毒株的序列同源性达到95%～97%;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的TGEV-N-cDNA;对猪传染性胃肠炎(TGE)的病料进行RT-PCR鉴定,可检测出TGEVN基因片段。结果表明建立的RT-PCR方法对TGEV的检测敏感性高、特异性强,可用于TGEV感染的诊断和流行病学调查。     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

应用RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究

根据GenBank已发表的猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)N蛋白的基因序列,设计合成1对引物,扩增片段长度为730 bp,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了检测TGEV的RT-PCR检测方法,并用该方法对疑似TGEV的猪群临床腹泻疾病进行了诊断检测和分析。本研究建立的TGEV检测方法,特异、灵敏、可靠,为该病的诊断和流行病学调查研究提供了技术保障。     

RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究

根据GenBank发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突蛋白S基因的5′端核酸序列设计了1对引物。该对引物扩增的目的片段长度为690bp。在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了TGEV的RT-PCR检测方法。     

TGEV-PEDV二重RT-PCR检测方法的建立及应用

本试验旨在建立能同时检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的二重RT-PCR检测方法。首先根据Gen Bank收录的TGEV和PEDV的基因序列,设计扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的特异性引物,然后通过优化二重PCR的体系建立一个二重RT-PCR检测方法。用该方法对临床收集的10份粪便样品进行检测,初步表明本研究建立的二重PCR方法具有良好的特异性和灵敏度,能用于临床诊断及流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立

为了研究出一种快速、敏感、特异的诊断猪传染性胃肠炎和猪流行腹泻的方法,试验参照国内外已发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因序列及其相关的RT-PCR检测方法,根据猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因和猪流行性腹泻病毒s蛋白基因各设计1套特异性通用引物,扩增目的带分别为426 bp和584 bp.结果表明:建立的猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法具有快速、敏感、特异等优点,可为猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测、流行病学调查及疫苗使用等奠定基础.     

猪伪狂犬病病毒、轮状病毒、传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒多重PCR的构建及应用

本试验的目的在于建立可同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪轮状病毒(RV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的多重PCR检测方法.试验设计并合成了4对特异性引物,对样品中的PRV,RV,TGEV和PEDV进行了多重PCR扩增.结果显示,该方法可同时扩增出PRV(497 bp),RV(1356...     

一步法多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒方法的建立和应用

根椐Gen Bank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PARV)基因序列,分别设计3对引物,在建立各病毒单项一步法RT-PCR技术的基础上,优化多重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的一步法多重RT-PCR检测方法,用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV和PARV核酸模板进行多重RT-PCR扩增,结果可同时扩增PEDV的450 bp、TGEV的609 bp、PARV的241 bp特异性片段,而对其它4种病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR技术能检出10 pg的PEDV、10 pg的TGEV和1 pg的PARV模板。用67份临床病料对建立的多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

检测猪流行性腹泻病毒的R-PCR方法的建立

根据猪流行性腹泻病毒 (PEDV)的N基因自行设计和合成了一对可扩增长度为 641bp目的片段的引物 ,成功地建立了检测的猪流行性腹泻病毒的RT PCR方法。对猪轮状病毒 (PRV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)的RT PCR检测结果均呈阴性。对PEDV JS株的RT PCR产物的序列分析表明 ,与CV777株的同源性为 97 3 %。     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二重PCR检测方法的建立

通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为10⁴ 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,采用RT-PCR扩增PRRSV N基因266bp片段,并克隆到pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立了PRRSV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.3×101拷贝/μL,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪日本脑炎病毒(JEV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明,建立的PRRSV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒病(PRRS)的诊断。     

鉴别猪流行性腹泻疫苗毒株与野毒株巢式PCR检测方法的建立及初步应用

根据Gen Bank中猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因序列分别设计两对引物,在完成最佳条件筛选、特异性、敏感性试验的基础上,建立一种快速区分PEDV疫苗毒株与野毒株的巢式PCR检测方法。建立的PCR快速检测方法能分别对PEDV疫苗毒株和野毒株扩增出特异性片段,片段大小分别为774 bp、150bp。该方法对传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(Po RV)、猪瘟病毒(HCV)、伪狂犬病病毒(PRV)则不能扩增出特异性片段。该方法具有快速、灵敏、特异、通用等特点,可用于实验室的快速诊断、分子流行病学的调查和野毒株的分离鉴定。     

应用套式PCR检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的试验

根据猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的S基因核苷酸序列，设计合成了2对引物，以猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒细胞培养物为模板，进行PCR特异性片段扩增，猪传染性胃肠炎病毒扩增片段大小为886bp，猪呼吸道冠状病毒扩增片段大小为214bp。建立的套式PCR经过特异性、敏感性试验及对临床送检样品检测，证明本法具有快速、特异和高度敏感的特点。     

猪传染性胃肠炎病毒NASBA检测方法的建立

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)NASBA的检测方法,本研究利用BioEdit和BlastN,根据GenBank中猪TGEV的S基因保守序列设计引物,建立了扩增TGEV的NASBA检测技术。利用该方法建立的反应体系在41℃反应2h即可得到有效扩增。实验结果表明:该方法对TGEV进行扩增获得约200bp特异性目的条带,而对CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、PEDV和ST细胞扩增结果均为阴性。NASBA的灵敏度高于普通RT-PCR,与病毒分离方法相当,可检测到5pg的核酸。该方法为TGEV的早期诊断提供了新途径。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,针对TGEV N基因全序列设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株为模板,建立了检测TGEV的RT-PCR方法.应用该方法对TGEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1 168 bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGEV不同毒株序列的同源性为95%～97%;敏感性测定结果为可扩增到18 pg的TGEV N基因cDNA.结果表明,建立的RT-PCR方法对TGEV的检测敏感性高、特异性强,可用于TGEV感染的诊断和流行病学调查.     

PEDV、TGEV、PoRV和PKV多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV),根据PEDV的M基因、TGEV的N基因、PoRV的VP6基因和PKV的3D基因序列设计4对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测4种病毒的RT-PCR诊断方法,该方法可特异性扩增这4种病毒的相应片段,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)均无扩增,最低检出量分别为1.33×10^4、1.33×10^3、1.33×10^4、1.33×10^5copies/μL。应用该方法对临床55份猪腹泻样品进行检测,结果检测出14份PEDV、1份PoRV和27份PKV,未检出TGEV,其中PEDV和PKV混合感染9份。上述结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于以上4种腹泻病毒的临床检测和流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎病毒LJ-12株的分离与鉴定

对黑龙江省某猪场腹泻仔猪的粪便进行病毒分离,获得1株疑似猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),命名为LJ-12株。在原代猪肾细胞上盲传8代后细胞出现病变,用TGEV S基因的1段特异性引物进行RT-PCR方法检测,扩增出与预期结果相一致的约480 bp的目的基因片段;核酸序列测定结果表明该段基因与TGEV TH-98株的核苷酸同源性为98.5%,氨基酸同源性为98.8%;并通过间接免疫荧光试验,超薄切片电镜观察等方法确定该分离毒株为猪传染性胃肠炎病毒。     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得到3条与试验设计相符的1 060bp(TGEV)、462bp(PEDV)及258bp(PBoV)特异性条带,建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法。结果表明,在同一PCR反应体系中,可以同时检测这3种病毒核酸片段,而对其他病毒的检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法的最低检测限分别为35、20、10pg的核酸。采用该方法对60份临床样品进行检测,TEGV阳性率为1.6%,PEDV阳性率为6.7%,PBoV阳性率为21.7%,表明建立的方法可以应用于临床检测。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用

根据Gen Bank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的N基因,针对其保守序列,设计并合成1对引物,可特异性扩增长度为590 bp目的条带,成功建立了检测TGEV的RT-PCR方法。以等量同一浓度的同一TGEV阳性病毒液进行重复性试验,其3次扩增特异性条带大小均为590 bp。以猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV),猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(RV)进行特异性试验,其结果显示仅TGEV扩增得到预期特异性目的条带。以TGEV阳性病毒液提取的c DNA用紫外分析仪确定核酸质量浓度为1 g/L后,用dd H2O按10倍稀释,稀释度为10-1~10-5,其均能扩增出590 bp特异性条带。在猪传染性胃肠炎高发季节的2013年9月至2014年1月对四川成都、德阳、绵阳、遂宁、南充各地猪场送检的疑似猪传染性胃肠炎感染病猪的临床样品15份,进行检测,其猪传染性胃肠炎阳性率为100%。并且对四川成都、德阳、绵阳、遂宁、南充各地猪场保育舍随机采集的1~10周龄仔猪临床样品500份,进行检测,其1~2周龄仔猪传染性胃肠炎阳性率为17%,病死率为100%,3~4周龄仔猪传染性胃肠炎阳性率为14%,病死率为78.6%,5~6周龄仔猪传染性胃肠炎阳性率为9%,病死率为44.4%,7~8周龄仔猪传染性胃肠炎阳性率为4%,病死率为25%,9~10周龄仔猪传染性胃肠炎阳性率为1%,病死率为0%。从地区来看,在这500份样品中,成都、德阳、绵阳、遂宁、南充地区此病的阳性率分别为15%,6%,10%,6%,8%。以上结果显示所建立的TGEV RT-PCR检测方法,重复性好,特异性强,敏感性高,可用于该病的临床诊断。