猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的构建

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR/PCR扩增,分别扩增出大小为308 bp和417 bp的部分基因片段。用T4连接酶将目的片段与pGEM-Teasy载体系统连接,并转化到大肠杆菌DH-5α株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV和PCV2的阳性重组质粒。将重组标准质粒10倍系列稀释后作为模板,通过实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR),建立了PRRSV、PCV2的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为分析PRRSV和PCV2共感染猪体内病毒的绝对含量提供了必要的技术平台。     

热应激对嵌合猪圆环病毒1-2在PK-15细胞中增殖的影响

为提高表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的重组猪圆环病毒1型(PCV1)疫苗株(嵌合猪圆环病毒1-2,PCV1-2)在细胞内的增殖水平,本研究采用PK-15细胞,应用活细胞计数、间接免疫荧光及Taq Man荧光定量PCR等方法测定不同热应激温度和持续时间处理后细胞生长和病毒增殖的情况。结果显示,PK-15细胞可耐受41℃和43℃的培养环境,并且与常规培养方法相比43℃条件下热应激处理12 h可显著促进PCV1-2在细胞内的增殖,其病毒效价可达10~(6.0)TCID(_50)/m L以上。另外,热应激处理后病毒核酸拷贝数的动态变化表明,热应激对PCV1-2复制的影响主要在接毒后24 h至48 h内显现。本研究确定了促进PCV1-2增殖的热应激条件,为提高PCV1-2疫苗产量提供了方法。     

猪圆环病毒2型的分离鉴定及优化培养

为研究圆环病毒病的流行情况及防治奠定基础,从湖北省某些大型养猪场采集临床上表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病死猪的淋巴结、脾等组织病料,进行病毒分离和鉴定。对分离病毒进行了间接免疫荧光鉴定、电子显微镜鉴定、核苷酸序列比对分析及动物感染试验;同时对病毒的培养条件进行优化,用RT-PCR检测感染细胞中的病毒核酸含量。结果表明,从猪病料中分离到1株猪圆环病毒2型(PCV2),命名为PCV2-WH。分离毒株经间接免疫荧光可检测到特异的PCV2荧光斑,电子显微镜下可观察到直径17 nm大小、圆形病毒粒子;利用一对圆环病毒2型ORF2基因引物进行了PCR扩增,将所得序列与GenBank收录的9株圆环病毒2型ORF2基因的核苷酸序列比对,同源性为98.2%～99.9%。非免疫猪接种出现明显的临床症状和病理变化。优化培养的结果显示,细胞与病毒同步接种培养24 h后,用300 mmol/L D-氨基葡萄糖于37℃作用30min后继续培养48 h的病毒滴度最高。本研究为进一步开展该病毒的致病性、疫苗免疫、诊断及分子生物学等研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型吉林地方株ORF2基因的克隆、测序及其在原核细胞中的表达

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列，设计合成1对特异性引物，用PCR方法从接种PCV2吉林株（JL01）PK-15细胞中，扩增出PCV2毒株的ORF2基因。将扩增片段克隆于pMD18-T载体，进行序列测定。结果表明，PCV2JL01毒株的ORF2基因核苷酸长度为702bp。将重组质粒用Sal Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后与同样处理的pET-32a载体连接，转化BL21细胞后，挑取阳性克隆。经PCR和酶切鉴定后，用IPTG诱导，细菌裂解液经SDS—PAGE和Western—blot分析，表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达，并能被PCV2阳性血清所识别。     

适合猪圆环病毒2生长的PK15均质细胞株的构建

<正>为筛选出PCV2培养滴度最高的PK15细胞克隆株,采用稀释法从PK15混合细胞中分离单细胞克隆株,获得的细胞克隆用于接毒试验,即用同步接种法将猪圆环病毒2(PCV2)病毒细胞混合液以1∶100的比例接种单克隆细胞,接毒后经PCR与定量PCR检测得出A10细胞克隆培养PCV2,获得的病毒含量最高。将A10细胞进行第     

猪圆环病毒1型反向遗传操作系统的初步构建

为构建猪圆环病毒1型的反向遗传操作系统,试验参考GenBank中已发表的PCV1序列,设计1对特异性引物,应用PCR方法扩增PCV1全长基因组,将其定向克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中,并对其进行PCR、双酶切鉴定及DNA序列测定;将构建好的重组质粒转染到PK-15细胞中,经3次连续传代后,用PCR方法检测转染后盲传细胞中PCV2核酸,经测序鉴定所拯救出的病毒与亲本病毒核苷酸同源性为100%。结果表明:构建的PCV1感染性克隆具有感染性。PCV1反向遗传操作系统的成功建立为进一步研究PCV基因组的功能及新型疫苗的研发奠定了基础。     

断奶仔猪多系统衰竭综合征的诊治

正1病情简述断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)是由猪圆环病毒(PCV)Ⅱ型引起的一种新传染病,临床症状以仔猪先天性震颤,断奶猪发育不良、咳嗽、消瘦和黄疸为特征。自1999年以来,在北京、河北某些猪场相继发现了疑似PMWS的病毒,对病原进行电镜观察、间接免疫荧光试验、PCR试验,鉴定为PCVⅡ型,从而确定这些猪场也存在PMWS。2病原(1)猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)属于圆环病毒科圆环病     

猪圆环病毒2型2015JS株的分离鉴定及全基因序列分析

采用细胞传代法对PCR检测为猪圆环病毒2型(PCV2)阳性的病料进行病毒分离,通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)对分离的病毒进行初步鉴定,应用IFA测定分离株的TCID50。应用PCR特异性扩增出该分离株的全基因组,经测序后进行同源性和系统进化分析。结果:成功分离到1株PCV2毒株,全基因组长度为1 766 bp,命名为2015JS株,分离株在细胞上的TICD50为10-5.50,与乌拉圭毒株Uy99(Gen Bank登录号KP867050)的同源性最高(99.8%),同属PCV2d型;与丹麦PCV2c毒株DK1980PMWSfree(Gen Bank登录号EU148503)的同源性最低(94.3%)。研究结果为江苏PCV2流行病学的研究和遗传变异的防控提供了参考资料,也为江苏PCV2疫苗毒株提供了选择依据。     

猪圆环病毒2型ZJ/C株增殖条件的优化

为了在PK15细胞上获得更高滴度的猪圆环病毒2型(PCV2)ZJ/C株,本实验优化了细胞接种密度、接毒方法、接毒量与收获时间和冻融次数等条件。结果表明接种密度在2.5×10~5个/m L,同步接毒加D-氨基葡萄糖处理,接毒量为2%,接毒后90h收获,-20℃冻融2次,PCV2-ZJ/C株增殖效果最好。该结果为猪圆环病毒2型灭活疫苗(ZJ/C株)的生产提供了依据。     

猪圆环病毒血清I型和II型的PCR鉴别

根据基因库中猪圆环病毒 (PCV)的基因序列 ,设计并合成了 3条引物 ,建立复合PCR,对 2株 PK-1 5细胞及一些疑似 PCV感染的病料进行了 PCV检测。结果 2株 PK-1 5细胞和所有病料都可扩增出 PCV-1的基因片段 ,其中 1株 PK-1 5细胞和一些病料还扩增得到了PCV-2的 DNA片段。证明应用设计的引物进行复合 PCR快速检测 PCV可行 ,为 PCV的检测分型及 PCV相关疾病的诊断奠定了基础     

猪圆环病毒Ⅱ型Rep基因在PK15细胞中的表达及特性

为研究猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Rep基因在PK15细胞中的表达特性，通过PCR方法克隆了PCV2杭州株(HZ0201)Rep基因全长945bp片段，与真核表达栽体pCI—neo构建为重组质粒pCI-PCV2-Rep。pCI-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞后48h，通过RT-PCR可检测到PCV2 Rep mRNA的转录；用猪PCV2多抗血清作间接免疫荧光试验，可检测到Rep基因表达产物。在表达量低的细胞中，PCV2 Rep蛋白主要位于PK15的细胞浆，在表达量高的细胞中，细胞浆和细胞核中均含有大量的Rep蛋白，表明Rep对PK15细胞的细胞浆和细胞核的亲嗜性没有明显差别。     

猪圆环病毒2型原位杂交检测技术的建立与应用

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列设计引物，利用PCR扩增得到PCV2BF株341bp的核酸片段，用随机引物法制备出地高辛标记的核酸探针。制备的探针与PCV1、PRRSV、PPV、PRV等不发生反应，可检测的最低PCV2DNA含量为1．78Pg。对30份临床组织样本进行了检测，并与PCR比较，结果表明，阴性符合率为100％，阳性符合率为88．9％。应用原位杂交技术分析了PCV2在人工感染仔猪主要组织中的分布，结果表明，感染后3d，从仔猪的淋巴结、胸腺、肺脏、脾脏、鼻黏膜可检测到阳性信号，感染后21d，肝脏、肾脏、胰腺和回肠可检出阳性信号，至感染后42d，可从心脏、胃、脑检出阳性信号。在整个试验过程中会厌软骨、膀胱、皮肤、肌肉等组织均为阴性。本研究结果表明，建立的PCV2原位杂交技术具有良好的敏感性和特异性，可用于PCV2的实验室诊断和感染靶细胞的定位分析。     

Viral replication and lesions in BALB/c mice experimentally inoculated with porcine circovirus isolated from a pig with postweaning multisystemic wasting disease

Eight-week-old BALB/c mice were either sham inoculated (control mice) or were inoculated intraperitoneally (IP) and intranasally (IN) with a single (sPCV mice) or multiple (mPCV mice) doses of porcine circovirus 2 (PCV2). Four control mice and 4 sPCV mice were sacrificed 7, 14, 28, and 42 days postinoculation (PI). All 4 mPCV mice were sacrificed 42 days PI. In addition, 7-day and 14-day pregnant BALB/c mice were either sham inoculated (control mice) or were inoculated IP and IN with a single dose of PCV2. Newborn mice were euthanatized 1, 8, and 15 days after birth. Necropsies were performed on all euthanatized mice and tissues were collected for histopathology, electron microscopy, in situ hybridization, and polymerase chain reaction (PCR). PCV2 replicated in 8-week-old BALB/c mice that were inoculated with PCV2 and caused fetal infection when inoculated into pregnant BALB/c mice at 7 days and 14 days of gestation. PCV was detected by in situ hybridization and PCR in sPCV mice on days 7, 14, 28, and 42 PI; in mPCV mice on day 42 PI; and in newborn mice from mothers inoculated with PCV at 7 days and 14 days of gestation at 1, 8, and 15 days after birth, but not in control mice. No clinical signs or gross lesions were found in sPCV or mPCV mice during the study. Microscopic lesions in sPCV mice and mPCV mice were characterized by expansion of germinal centers in lymphoid organs with large numbers of histiocytic cells and lymphoblasts, apoptosis of histiocytic cells in germinal centers, and mild lymphoid depletion of the paracortex. PCV nucleic acid was detected in the nuclei and cytoplasm of histiocytes and apoptotic cells in germinal centers in lymphoid tissues as well as in the nuclei of hepatocytes in the liver, in the nuclei of renal tubular epithelial cells, and in the cytoplasm of single lymphocytes in the thymus. Congenitally infected mice only had PCV nucleic acid detected in putative Kupffer cells in livers.     

猪圆环病毒2型遗传标记毒株的构建及生物学特性鉴定

以临床分离的猪圆环病毒2型（PCV2）为材料，利用PCR法扩增病毒基因组，将2个基因组顺式连接插入到质粒载体中构建感染性分子克隆。通过引物设计替换碱基，在病毒基因组内插入Sal Ⅰ限制性内切酶位点作为遗传标记，经重组质粒转染细胞获得带有遗传标记的新毒株。采用免疫过氧化物酶单层细胞试验、免疫电镜、核酸序列分析表明，在病毒感染细胞中检出病毒特异抗原，其抗原性、病毒形态学及基因序列与亲本毒株一致。鉴于新病毒基因组内插入一个SalⅠ酶切住点，用PCR与限制性片段长度多态性分析法可与野生型病毒相鉴别。新毒株经细胞连续传60代，体外培养增殖性能稳定，毒价可达10^6.6CID50/mL。取病毒培养物经静脉和滴鼻途径接种35日龄抗体阴性仔猪4头，接种后表现出体温升高、进行性消瘦、被毛粗糙及体表淋巴结肿胀症状，迫杀后多种脏器中均能检测到病毒抗原与核酸。研究表明，利用感染性分子克隆手段构建带有遗传标记的PCV2新毒株，为进一步开展该病毒的致病性、疫苗免疫、分子诊断等研究奠定了基础。     

PK15细胞α干扰素效应因子qPCR检测方法的建立及其初步应用

 
为建立一种用SYBR Green I荧光染料检测PK 15细胞α干扰素(α IFN)效应因子Mx1、OAS的mRNA表达水平的qPCR检测方法，通过在猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2, PCV2）抑制α IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。根据GenBank中目的基因的序列，利用分子生物学软件Premier 5.0在其保守区设计并合成相应的特异性引物。利用TRIzol法提取总RNA，经Oligo d(T)15进行反转录，利用PCR扩增各段目的基因，并克隆至pMD 18 T载体，转化大肠杆菌DH 5α，经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR Green I qPCR标准曲线和溶解曲线，并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时qPCR方法，检测PCV2对α IFN效应因子的抑制效果。对建立的PK 15细胞α IFN效应因子SYBR Green I qPCR方法进行分析，结果表明Mx1、OAS和内参β actin基因的Ct值与标准品稀释度在1×101～1×108 copies/μL的范围分别呈良好的线性关系。PK 15细胞在接种PCV2，并受到α IFN刺激后Mx1、OAS的相对表达量较未接种PCV2明显降低。本试验建立了PK 15细胞α IFN效应因子的qPCR检测方法，为在mRNA水平上对PK 15细胞α IFN效应因子的定量分析奠定了基础，并成功地初步应用于PCV2抑制α IFN发挥效应的信号通路研究中。     

猪圆环病毒2型感染PK-15细胞中外泌体的鉴定及其对细胞增殖和凋亡的影响

旨在分离感染PCV2的PK-15细胞分泌的外泌体,探讨其在PCV2感染淋巴细胞中的作用。提取PCV2感染PK-15细胞上清液中的外泌体,利用透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析测定外泌体粒径、Western blot检测外泌体标记蛋白分子（CD81、TSG101）;PKH67标记外泌体后检测细胞对外泌体的摄取;提取PCV2-外泌体基因组,检测PCV2 Rep和Cap基因;利用间接免疫荧光试验检测PCV2-外泌体感染PK-15细胞后PCV2病毒定位;通过绝对定量PCR检测PCV2-外泌体对淋巴细胞的感染率;利用CCK-8法检测淋巴细胞增殖;利用Annexin V-FITC/PI检测淋巴细胞凋亡率。透射电镜和外泌体粒径分析结果显示,PK-15细胞分泌的外泌体为双层膜的囊泡,直径30~200 nm;Western blot结果显示PK-15细胞分泌的外泌体存在特异性标记蛋白CD81和TSG101;外泌体摄取试验结果显示PCV2-外泌体能够被细胞摄取;PCR结果表明PCV2-外泌体基因组中含有PCV2 Rep和Cap基因;间接免疫荧光结果显示,与PCV2直接感染相比,PCV2-外泌体感染的淋巴细胞中,PCV2病毒拷贝显著升高,差异明显（P<0.01）,外泌体裂解后感染淋巴细胞能力与PCV2病毒无显著差异;PCV2-外泌体可显著抑制淋巴细胞增殖（P<0.01或P<0.05）;PCV2-外泌体显著提高淋巴细胞凋亡率。PCV2感染PK-15细胞的外泌体中携带病毒基因,感染淋巴细胞后使细胞增殖降低和细胞凋亡增加。     

In vitro studies on the infection and replication of porcine circovirus type 2 in cells of the porcine immune system

Porcine circovirus type 2 (PCV2) nucleic acid and/or antigens are consistently observed in cells of monocytic morphology in lesions of pigs affected by post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). In this study, PCV2 antigen was detected in the cytoplasm of monocytes, pulmonary macrophages (PMs) and monocyte-derived macrophages exposed to the virus in vitro, by immunofluorescence analysis (IFA) and the phenotype of these cells confirmed by detection of monocytic cell surface markers using flow cytometry. Viral antigen was not observed in lymphocytic cells. Replication of the virus in PMs was investigated further by comparison to that observed in the continuous pig kidney cell line (PK15A) using quantitative virus titration, quantitative PCR and by the detection of double stranded DNA intermediates of viral replication by Southern blotting analyses. Although increases in viral DNA and levels of infectious virus progeny and the presence of replicative intermediates, indicative of viral replication, were observed in PK15A cells, no such changes were observed in PMs in spite of the fact that infectious virus, viral antigen and viral DNA persisted in the cells for at least the duration of the experiment. These results suggest that in vivo, monocytic cells may not represent the primary target for PCV2 replication.     

猪场母猪与仔猪猪圆环病毒2型感染情况调查

为了解目前母猪和仔猪猪圆环病毒2型(PCV2)感染情况,本试验对来自于15个猪场的85份母猪血清和29个猪场的55份仔猪可疑病料(脾脏、淋巴结、肾脏等),分别采用间接ELISA和PCR法进行PCV2抗体和病毒核酸检测。结果显示,在15个猪场中,1个猪场母猪抗体呈阴性,其他14个猪场母猪抗体均呈阳性,猪场PCV2阳性检出场为93.3%(14/15),85份母猪血清抗体总阳性率为75.3%(64/85)。29个猪场的仔猪,PCV2核酸检测阳性猪场为19个,猪场阳性率为65.5%(19/29),55份仔猪可疑病料病毒核酸检测总阳性率61.8%(34/55)。可见,母猪和仔猪感染PCV2相当普遍。对母猪群PCV2抗体阳性率及其仔猪群病毒核酸阳性率进行比较发现,母猪群PCV2抗体阳性率越高其仔猪群病毒核酸阳性率却越低。