新疆小反刍兽疫疫情诊断

2013年12月新疆伊犁州霍城县发生不明山羊疫情,根据临床症状和剖检变化怀疑为小反刍兽疫感染。对3只病死山羊病料、8只患病山羊分泌物棉拭子样品和6只患病山羊血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用竞争ELISA试剂盒对6份血清样本进行抗体检测,结果全部为阳性。利用抗原捕获ELISA试剂盒,在11只病羊样品中都检测到小反刍兽疫抗原。利用能特异性检测小反刍兽疫病毒的荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊样品中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用特异引物进行PPRV N基因片段RT-PCR反应,从11只病羊样品中检测到PPRV核酸。针对2号样本病原核酸N基因和F基因片段进行序列同源性比较,结果该毒株与西藏流行株序列片段相似性分别为96.5%和97.5%。遗传进化分析,该病原属于谱系4,与巴基斯坦等国流行毒株遗传关系最近。     

湖北省首例山羊小反刍兽疫疫情诊断

2014年3月底湖北省恩施州鹤峰县养羊户从外省购入山羊后,山羊出现发热、咳嗽、流涎、腹泻等小反刍兽疫疑似症状。采集3只病死山羊病料、8只发病山羊棉拭子和8份血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用阻断ELISA试剂盒对8份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性;利用小反刍兽疫病毒特异性荧光定量R T-PCR方法,从11只病羊样品中均检测到小反刍兽疫病毒核酸,结果经国家外来动物疫病研究中心复核确认,确诊为湖北省首例山羊小反刍兽疫疫情。     

小反刍兽疫实验室诊断

为了对小反刍兽疫疑似病例进行实验室确诊,采集疑似小反刍兽疫病羊材料,用实时荧光定量RT-PCR检测方法以及一步法RT-PCR检测方法进行检测,并针对小反刍兽疫N基因序列设计引物扩增N基因并进行克隆测序及序列分析。试验结果可见,疑似小反刍兽疫病羊临床剖检表现为胃肠道及肺部出现坏死,肠道出现线状出血。实时荧光定量RT-PCR和一步法RT-PCR方法检测结果显示均为小反刍兽疫病毒(PPRV)核酸阳性。N基因测序结果 China-GZ株与小反刍兽疫4个支系毒株序列比对显示,核苷酸同源性为89.0%~97.3%。本试验通过临床症状表现和实验室分子生物学诊断确诊该病例为小反刍兽疫病毒感染所致。     

一步法RT-PCR检测小反刍兽疫病毒

为建立一步RT-PCR检测小反刍兽疫病毒(PPRV)方法,针对Gen Bank中PPRV F基因进行序列比较分析,设计一对特异性引物,通过优化RT-PCR反应条件,建立了一步RT-PCR检测PPRV方法。该方法最佳退火温度为60℃,最佳引物用量为8pmo L/μL。利用这种方法对小反刍兽疫临床阳性样本进行检测,获得了特异性的扩增目标条带,但不与口蹄疫病毒、羊口疮病毒、犬瘟热病毒等发生反应。本方法具有高度灵敏性,最低检测量为3.576×10-5g/L,可广泛应用于临床小反刍兽疫病毒核酸的检测。     

土耳其红海地区绵羊小反刍兽疫的流行病学调查、RT-PCR诊断和病毒分离

在本研究中,在红海中部和西部的4个不同省圈养的34个绵羊群,从临床和病理特点判断疑似小反刍兽疫病毒感染的绵羊及羊羔群(n=57)中,取得164份病料(肺、脾、淋巴结、鼻和眼拭子、血液以及口腔样品)用于RT-PCR及病毒分离。另外,在同一地区从892头绵羊中随机收集血清样本测定小反刍兽疫病毒的血清流行率。抽样动物和抽样省的血清流行率分别为14.9%和3.5%~38.2%。同时在Vero细胞中未能分离到病毒,通过RT-PCR在164份材料中检测到26份有PPRV的核酸。根据RT-PCR的结果,群体和抽样动物的PPRV阳性率分别为44.1%(15/34)和31.5%(18/57)。尸体剖检材料(如淋巴结、脾、肺)和临床样品(如鼻拭子和结膜拭子)应用RT-PCR方法诊断是否为小反刍兽疫病毒感染更具有诊断价值。数据显示红海的中部及西部地区普遍存在小反刍兽疫感染,由于地理条件(如气候等)及饲养方法的不同,不同地区病毒的感染流行情况也不同;同时表明,RT-PCR是诊断PPRV感染的灵敏、可靠的方法。     

几种外来动物病毒多重普通和实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用

为了能够同时开展对小反刍兽疫病毒(PPRV)、蓝舌病血清8型病毒(BTV8)、鹿流行性出血热血清1型病毒(EHDV1)和非洲马瘟病毒(AHSV)4种外来动物疫病病原体的核酸检测,本试验根据GenBank中相关病毒序列设计引物和探针,建立多重普通逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在采集的临床样本检测中进行初步应用验证。结果显示：建立的PPRV/BTV8/EHDV1三重实时荧光定量RT-PCR检测方法仅对PPRV、BTV8和EHDV1有特异荧光信号,检测敏感度可达10^1.70～10^2.08copies/μL DNA;建立的PPRV/BTV8/EHDV1/AHSV四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测PPRV、BTV8、EHDV1和AHSV,检测敏感度可达10~3 copies/μL DNA;2种方法对羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、牛病毒性腹泻等临床相似的病毒均无扩增。在925份临床样本中检测出1例PPRV核酸阳性样本;经核苷酸序列测定及BLAST比对确定为谱系IV型PPRV毒株序列。本试验所建立的三重实时荧光定量...     

小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内的病毒分布

为了解小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内的分布情况,平行采集临床发病羊的脾脏、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、大肠、淋巴结以及眼拭子、鼻拭子、肛门拭子、血清等样品,应用荧光RT-PCR方法对各样品进行平行检测,比较各样品检测Ct值,评估病毒分布和各样品中的病毒含量,结果显示,所有样品小反刍兽疫病毒核酸均为阳性,其中大肠、肺脏、脾脏和淋巴结的检测Ct值较小,表明小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内呈全身分布,但在大肠、肺、脾和淋巴结等组织中的含量较高。     

小反刍兽疫病毒液相芯片检测方法的建立及初步应用

为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)液相芯片检测方法,根据Gen Bank上公布的PPRV的N蛋白基因序列高度保守区设计引物与探针;对探针进行C12臂修饰后与荧光编码微球偶联,将偶联后的探针与PPRV的PCR产物进行杂交,在Bio-Plex系统上读取荧光信号,建立了小反刍兽疫病毒液相芯片检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行了研究,最终用建立的方法对临床样本进行检测。结果显示,该方法只与PPRV基因的PCR产物反应,而不与其他病毒基因反应,可检出的最低基因拷贝数为5. 78×104copies/m L,表明该方法具有良好的特异性与敏感性。利用该方法对25份临床样本进行检测,共检出阳性样本15份,与传统PCR方法检测结果一致。本研究建立了小反刍兽疫病毒的快速液相芯片检测方法,为进一步建立多种外来动物疫病的液相芯片检测方法奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒特异性IgY抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

本研究制备了针对小反刍兽疫PPRV全病毒特异性卵黄抗体,利用PPRV N蛋白特异性单克隆抗体和PPRV IgY为主要材料,建立了PPRV双夹心ELISA检测方法检测小反刍兽疫病毒。用该ELISA方法分别检测小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水泡性口炎病毒、赤羽病病毒、口蹄疫病毒,结果表明该ELISA方法可以特异性检出PPRV而与其他病毒间无交叉。用该ELISA和RT-PCR同时检测162份临床样品,结果表明ELISA的特异性和敏感性分别为99.2%和93.7%,两种方法的符合率为98.1%。该方法的建立为小反刍兽疫病毒的初筛检测及小反刍兽疫流行病学调查提供了经济、快速、有效的方法,适用于设备条件不足的基层实验室。     

2014年我国小反刍兽疫发生概况及其防治

<正>小反刍兽疫(又称小反刍兽伪牛瘟)是由小反刍兽疫病毒(pestedes petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、热性、高度接触性A类动物传染病[1]。PPRV主要感染小反刍兽如山羊、绵羊、野羊等,尤其以3~8月龄山羊最易感[2];大反刍动物如牛、骆驼等也可感染带毒,呈亚临床感染;猪可通过实验感染,但不排毒,通常为无临床症状。PPRV不感染人,因此小反刍兽疫不属于人畜共患病。该病的主要传染源为患病动物和隐性感染者,病羊和带毒羊的分泌物和排泄物,污染的土壤、饲草、饮水及垫料等均是该病的传播媒介。小反刍兽疫以发热、咳     

荧光定量RT-PCR法对犬瘟热病毒PS株感染犬血清和粪便中病毒的检测

为研究犬人工感染犬瘟热病毒(CDV)后病毒在血清和粪便中的含量及变化,本实验根据CDV核衣壳蛋白(NP)基因序列设计一对特异引物,扩增NP基因.并以NP基因重组质粒作为阳性标准品,建立检测CDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法.结果表明,该方法102拷贝～109拷贝范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.998,扩增效率为E=98.3％,敏感度高,最低检测限为6.1拷贝/μL,重复性检测变异系数低于2.62％.该方法与常规RT-PCR方法比较,其敏感性提高102倍.两只人工感染CDV PS强毒株的犬,分别于接种后17d、19d发病死亡,采用荧光定量RT-PCR方法对人工感染犬的血液和拭子液中的病毒核酸栽量进行定量检测以及对收集的22份临床样本拭子液进行检测,均检测到CDV.本研究结果表明,该方法可以用于CDV核酸定量检测,为该病毒的致病机理及病毒传播途径的研究提供了一种快速和敏感的检测手段.     

猪瘟病毒一步法RT PCR检测方法的建立

本研究根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列，设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物。自疑似猪瘟病料及接猪瘟F114毒的PK-15细胞中提取总RNA，经一步法RT-PCR扩增E2基因。建立了猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法，RT-PCR从26份疑似猪瘟病料中检出阳性病料24份，阳性检出率为92.3%；结果表明，建立的 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于CSFV的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

用荧光定量RT-PCR方法检测猪瘟病毒

为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10~(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。     

禽黄病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

禽黄病毒病是新发的一种疫病,可引起鸭、鹅和鸡等家禽产蛋和采食量下降及死亡。本研究旨在建立一种快速诊断方法用于临床诊断及流行病学调查。根据GenBank发表的鹅黄病毒JS804株全基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计了2对特异性引物,建立了禽黄病毒套式RT-PCR检测方法。结果:该套式RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高的特点,最低病毒检测量为101.89TCID50/0.1 mL,比普通RT-PCR方法敏感性高1 000倍。应用该方法对江苏地区疑似禽黄病毒病的70份鹅病料、4份鸭病料、12份鸡病料进行检测,总阳性率为58.14%,而用普通RT-PCR方法检测的阳性率仅为17.44%。结果表明,禽黄病毒套式RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点,可用于禽黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒的RT-PCR快速诊断技术研究

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的N基因序列设计了一对引物,建立诊断PRRSV的RT-PCR技术。使用该方法对山东某些地区疑似为PRRS的28份送检样品进行检测,结果4份为阳性,证实山东存在PRRSV的流行。RT-PCR方法的建立为PRRS的快速、准确诊断以及进行分子流行病学的调查提供了新的技术手段。     

RT-PCR鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株与强毒株方法的建立

根据GenBank中公布的小反刍兽疫病毒的H基因或全基因序列,利用软件Primer Premier5.0设计引物,扩增片段长度为477bp,建立区分小反刍兽疫疫苗毒与基因4系野毒的RT-PCR检测方法,并用于临床检测。结果表明,建立的RT-PCR鉴别诊断方法能特异性区分疫苗株Nigeria75/1与基因4系PPRV,与基因3系、牛瘟病毒、犬瘟热病毒等同属病毒无交叉反应;最低可以检测到浓度为7.7×10-5ng/μL的RNA模板;该方法操作简单,耗时短,可以初步用于临床鉴别诊断。     

不同引物RT-PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的比较研究

用3对分别针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7、ORF5和ORF5的PCR引物N1/N2、AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2进行RT-PCR,检测PRRSV,从其敏感性、特异性和临床样品检出率等方面进行比较,在此基础上进一步建立一步法RT-PCR检测方法。结果显示:3对引物对PRRSV均有很高的特异性;应用N1/N2引物病毒最低检测量为7.9 TC ID50,而AdGP5.1/AdGP5.2引物和RFLP5.1/RFLP5.2引物PCR最低检测量为79 TC ID50;运用N1/N2、AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2引物分别进行RT-PCR扩增检测临床样品,PRRSV检出率分别为28/48、27/48和25/48,且用AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2引物检测的阳性样品,用N1/N2引物检测也都呈阳性。运用N1/N2引物,通过一步法RT-PCR成功地从PRRSV S1株中扩增出374 bp的目的基因片段。结果表明,用N1/N2引物扩增PRRSV目的基因,其敏感性和临床样品检出率更高,更适合临床样品PRRSV的检测。     

Rapid and sensitive detection of African horse sickness virus by real-time PCR

A highly sensitive and specific TaqMan-MGB real-time RT-PCR assay has been developed and standardised for the detection of African horse sickness virus (AHSV). Primers and MGB probe specific for AHSV were selected within a highly conserved region of genome segment 7. The robustness and general application of the diagnostic method were verified by the detection of 12 AHSV isolates from all of the nine serotypes. The analytical sensitivity ranged from 0.001 to 0.15 TCID₅₀ per reaction, depending on the viral serotype. Real-time PCR performance was preliminarily assessed by analysing a panel of field equine samples. The same primer pair was used to standardise a conventional RT-PCR as an affordable, useful and simple alternative method in laboratories without access to real-time PCR instruments. The two techniques present novel tools to improve the molecular diagnosis of African horse sickness (AHS).