鹅细小病毒LH株的纯化及其生物学特性

取鹅细小病毒(GPV) LH株毒液,通过氯仿去除杂蛋白,用氯化钠与聚乙二醇-6000相结合方法粗提后,经蔗糖密度梯度离心纯化.通过PCR方法对不同浓度蔗糖溶液进行检测,取纯化毒液进行蛋白电泳及电镜观察,并无菌接种12日龄鹅胚,对死亡胚尿囊液进行PCR鉴定.试验结果显示:浓缩纯化后的GPV主要分布在50％～65％蔗糖浓度区间,病毒的蛋白含量为216 μg/L;电镜观察结果表明,病毒粒子分为实心和空心2种,直径大小在20～22nm;经SDS-PAGE电泳可看到多个条带,主要蛋白大小与病毒蛋白VP1、VP2和VP3相对应.纯化后的病毒接种敏感鹅胚仍可致其100％死亡,死亡胚具有特征性的病变,尿囊液经PCR鉴定,呈GPV核酸阳性.本试验所用方法获得的纯化GPV病毒液的纯度高且保持了该病毒的毒力特性,是一种方便可行的纯化该病毒的方法.     

H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H5、H7、H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)编码基因,使用DNAStar软件比较分析筛选出特异的保守片段,设计3对引物H5-P1/H5-P2、H7-P3/P4和H9-P5/P6。在此基础上,建立了H5、H7、H9亚型禽流感的三重RT-PCR检测方法,本方法可同时检测出样品中的H5、H7、H9亚型禽流感病毒。敏感性试验结果表明,该方法检测H5、H7、H9亚型禽流感RNA的敏感性分别达2.80、10.50、5.73 pg/μL,该方法检测其他相关病毒时均为阴性,具有很高的特异性,此外,该方法具有良好的重复性。利用所建立方法对240份禽流感临床样品进行检测,结果与血凝试验和血凝抑制试验结果的符合率为100%。此诊断方法检出时间早,且特异、敏感、经济、快速,可普遍推广,在禽流感诊断和防制中具有重要意义和应用价值。     

鸡源坦布苏病毒（SN01株）的分离与鉴定

采用SPF鸡胚与vero细胞传代接种法,从江苏某蛋鸡场临床表现为产蛋下降、卵泡萎缩、全身多器官出血为主要特征的发病鸡肝脏、卵巢病料组织中分离一株病毒。该分离毒不能凝集鸡和鹅红细胞, 并对乙醚、氯仿敏感;病毒核酸为RNA;PCR结果排除了分离毒为禽流感病毒、新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒;用坦布苏病毒特异引物扩增为阳性, 序列测定与分析结果显示分离毒与GenBank上登录和实验室保存的坦布苏病毒E基因序列同源性在99%以上。上述结果表明分离毒（SN01）可能是一种新的坦布苏病毒,属于黄病毒科坦布苏病毒属,暂称为鸡源坦布苏病毒。     

新型黄病毒在种鹅中垂直传播的研究

[目的]证实新型黄病毒在种鹅中是否存在垂直传播,为控制该病提供可靠的流行病学依据.[方法]采用巢式RT-PCR和病毒分离技术,对患病种鹅病料、不同孵化阶段死胚、出雏蛋壳内部冲洗液、弱雏样品进行黄病毒分离及基因检测.[结果]在患病种鹅、孵化过程中死亡鹅胚尿囊液、出雏蛋壳内壁洗液和雏鹅中均能检测和分离到黄病毒,其中患病种鹅病料的黄病毒阳性率为100.0%,孵化死亡鹅胚黄病毒阳性率为39.6%,出雏蛋壳内部冲洗液黄病毒阳性率为45.0%;1日龄和15日龄弱雏黄病毒阳性率为80.0%.[结论]黄病毒可以通过鹅胚传到下一代,即新型黄病毒在种鹅中存在垂直传播的现象.     

不同浓度格利特消毒剂对鸡粪中H9N2亚型禽流感病毒杀灭效果观察

为验证在有机物存在下格利特(20％戊二醛溶液)消毒剂杀灭禽流感病毒的能力,试验模拟空栏鸡舍和周围环境消毒实际情况,在鸡粪中混入H9亚型禽流感病毒,以接种鸡胚尿囊液中H9亚型禽流感病毒血凝价＜2 log2判为感染阴性,以样品经消毒剂作用后检测不到病毒含量(即0EID50)为病毒完全杀灭(100％杀灭病毒),研究格利特消毒剂杀灭禽流感病毒的效果,结果显示:1∶400以下稀释的格利特消毒剂4℃或25℃作用20 min,均能100％杀灭混入鸡粪中的H9N2禽流感病毒;1∶200稀释的格利特消毒剂25℃作用20 min,能100％杀灭存在于鸡粪和清洁剂中的H9N2禽流感病毒.1∶1600以下稀释的格利特消毒剂25℃作用20 min,均能100％杀灭无鸡粪保护的H9N2禽流感病毒.     

鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS1的原核表达及纯化

根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。     

鹅副粘病毒HN蛋白的原核表达与免疫学鉴定

以GenBank登录的鹅源副粘病毒GPMV ZJI株基因组全序列为模板,在HN基因开放阅读框上下游设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增得到HN基因,将目的基因克隆至pET32a表达载体上,转化至BL21中,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达。由结果可知,通过RT-PCR法扩增出HN基因,大小与预期一致。SDS-PAGE和Western-blot均得到预期条带,说明pET32a表达载体在BL21中成功表达了HN蛋白,为后续相关免疫学研究奠定基础。     

鸭疫里氏杆菌RA JS01菌株的PCR鉴定及生物学特性

在临床疑似鸭传染性浆膜炎的病鸭组织中分离了1株RA JS01菌株,通过形态观察、生化试验和PCR鉴定,确定该菌株为鸭疫里氏杆菌,结果表明:该菌株对多数抗生素都具有耐药性和较强的致病性;经静脉和足底接种的鸭在接种后24 h时开始死亡,接种96 h时全部死亡;连续传至22代时菌株的生物学特性均未发生变化。     

检测坦布苏病毒病抗体NS1-ELISA方法的建立与初步应用

为建立快速检测鸭坦布苏病毒病抗体的血清学方法,本研究利用鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列将其克隆至原核表达载体pET32a上,建立重组表达pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中。经IPTG诱导得到NS1融合蛋白,融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性,纯化的坦布苏病毒NS1蛋白作为包被抗原,在最佳检测条件基础上,建立了检测坦布苏病毒病(Tembusu virus disease,简称TVD)抗体的间接ELISA方法。结果在条件优化后抗原最适包被量为1.925μg·孔-1,抗原最佳包被条件为37℃放置1 h后4℃过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,最佳封闭时间为1 h,酶标二抗最适稀释度为1∶1 000,显色时间10 min。阴阳性临界值判定标准为0.346。用建立的间接ELISA方法检测禽流感、新城疫、传染性支气管炎、TVD阳性血清样品均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。板内和板间重复试验的最大变异系数分别为6.7%和8.2%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接NS1-ELISA方法对81份疑似鸭坦布苏病毒病血清样品进行检测,有43份样品呈现阳性,E-ELISA有48份呈阳性结果,证明该方法具有较高的敏感性。NS1-ELISA方法的建立为TVB的诊断和流行病学调查提供了一种新的方法。     

鹅源坦布苏病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

坦布苏病毒是新发现的一种可引起家禽产蛋和采食量下降及死亡的黄病毒属病毒。根据GenBank中登录的鹅源坦布苏病毒NS5基因序列,利用Primer Explorer V4软件在序列保守区域设计1套特异识别NS5基因序列中6个不同区段的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,并以此套引物建立一种基于LAMP技术的鹅源坦布苏病毒检测方法。结果表明,该方法灵敏度极高,是普通PCR方法的100倍,只能特异性扩增坦布苏病毒的RNA,对于其他常见禽RNA病毒均无特异性扩增。在反应体系中加入SYBR GreenⅠ染料后,通过肉眼观察有无绿色荧光可直接判定结果。该方法特异性强,灵敏度高,无需特殊仪器,简便,快速,适用于鹅源坦布苏病毒的临床快速检测。