鹅细小病毒LH株的分离鉴定

采用鹅胚接种方法从南京六合具典型鹅细小病毒病病变的死亡雏鹅体内分离到1株鹅细小病毒(LH 株).在电镜下观察到该病毒液具细小病毒样粒子;8 日龄健康易感雏鹅人工感染后100%发病、死亡,且具有典型鹅细小病毒病临床症状和剖检特征.在琼脂扩散试验中,用感染鹅胚液制备的待检沉淀抗原,能与鹅细小病毒阳性血清发生特异性反应.应用针对GPV VP3特异性引物对LH毒液进行PCR检测,扩增出的片段为1.6 kb,与目的条带大小相符.序列分析发现,扩增产物与已发表的GPV的VP3片段相比较,同源性达99%以上,表明所分离到的LH株是一株鹅细小病毒.     

一种新鹅病毒病的研究

对湖北某地出现的一种皮下和内脏形成广泛性肿块的成年鹅的传染病病原进行了初步研究，将成年病死鹅和病鹅肝组织悬液接种12日龄鹅胚，48～72h鹅胚死亡，再用第一代鹅胚尿囊液连传3代均死亡．电镜检查经处理的这些鹅胚尿囊液，观察到大小为50～100nm有囊膜的病毒颗粒；接种鸡胚，48～96h死亡；回归到成年母鹅，出现与自然感染类似的病变；并对该病毒进行了核酸型鉴定，初步确定为微小RNA病毒，结果表明本病的病原是一种鹅的新病毒。     

鹅细小病毒与番鸭细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank上登录的鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)的基因序列,针对两种病毒非结构蛋白(NS)和VP1基因序列的相同区段,分别设计两对引物GPV U·L-1和MDPV U·L-1,以GPV-GZ1株的鹅胚尿囊液和MDPV的番鸭胚尿囊液提取核酸作为模板,分别建立了检测GPV和MDPV的PCR方法.特异性试验结果显示,引物GPV U·L-1仅特异性扩增出GPV-GZ1和GPV-GZ2株分子长为622 bp核酸片段,引物MDPV U·L-1仅特异性扩增出MDPV分子长为624 bp核酸片段,而对DPV、GPMV的核酸扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,建立的PCR方法能检测到0.144 Pg的GPV核酸和28.8 pg的MDPV核酸.结果表明,建立的PCR方法特异性强、敏感性高,可用于GPV或MDPV临床感染病例的鉴别诊断.     

禽腺联病毒的分离及其基因组鉴定

为了获得用于重组载体构建的禽腺联病毒(AAAV),用无菌处理后的鸡粪便样品与鸡胚致死孤儿病毒同时接种SPF鸡胚,根据已发表的AAAV基因序列设计引物,用PCR对致死鸡胚的尿囊液进行检测,结果从1份样品接种的鸡胚尿囊液中扩增到预期大小的AAAV Rep和Cap基因片段;对纯化后的PCR产物进行序列测定,将所获序列与已发表的AAAV Rep和Cap基因进行比较,其核苷酸序列同源性分别为97．1％和94．6％;将PCR检测阳性的尿囊液进行鸡胚传代,用PCR对不同时间死亡鸡胚的尿囊液进行再次检测,结果均扩增到预期大小的基因片段;提取病毒核酸,电泳观察到约4．7kb的AAAV基因组。说明已成功地从鸡粪便样品中分离到1株AAAV,为重组AAAV载体的构建打下了基础。     

鹅细小病毒PCR诊断方法的初步建立

根据GeneBank上已发表的鹅细小病毒(GPV)基因序列,设计合成1对引物,以GPV阳性毒株鹅胚尿囊液及攻毒后死亡的雏鹅组织,提取DNA并进行PCR,结果产物扩增出的片段与预期片段440 bp大小相符,测定序列与GeneBank上GPV B株同源性达99%。试验结果显示用该方法可以特异性地诊断出GPV,比琼脂扩散试验(AGP)敏感性高,可检测最低浓度为102.5GELD50/0.2mL;检测攻毒后死亡的雏鹅组织,在脑、肝、肺、肾、肠等组织中均有GPV的存在,可以用于临床可疑病毒的分离鉴定。所建立的PCR方法具有高度的特异性、敏感性和可重复性。     

鹅细小病毒PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中鹅细小病毒(GPV)的7株全基因序列,在相对保守的NS区域设计了一对引物,以GPV-98E株鹅胚尿囊液的核酸提取物为模板,经优化反应条件,建立了特异性检测GPV的PCR方法。敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为4.194 pg,尿囊液的最小检出量为3.09个ELD50;特异性试验结果显示,采用该方法检测GPV能够扩增出与预期大小相符的476 bp的特异性片段,而对作为对照的鸭瘟病毒(DPV)、禽流感病毒(AIV)、鹅副粘病毒(GPMV)的核酸均未扩增出任何条带。在临床检测中,对52份雏鹅的心、肝、肠等组织进行PCR扩增,能够检测到相应的特异性病毒核酸片段,表明建立的鹅细小病毒PCR检测方法具有敏感性高、特异性强的特点,具有潜在的临床应用价值。     

小鹅瘟地方株的分离鉴定及致病力试验

通过对当地鹅场发生的小鹅瘟疑似病例的病变肝脏进行病毒分离,将具有病变的肝脏加hanks液进行研磨后,低温反复冻融3次,除菌过滤后接种12日龄的鹅胚。收集死亡鹅胚的尿囊液,初步分离出鹅细小病毒,经电镜观察、琼脂扩散试验、血清保护试验鉴定为鹅细小病毒。动物回归试验表明,该病毒的潜伏期为5d,病程为1～3d,病死率达100%,对雏鹅半数致死量(LD50)为0.1mL 10-4.5稀释的病毒液。     

猪流感福建流行毒株的分离、鉴定

疑似猪流感(SIV)病猪的鼻拭子尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚,72 h后致死鸡胚.取尿囊液进行血凝试验,分离物能使多种禽类和哺乳动物红细胞发生凝集;取尿囊液接种鸭胚、鹅胚,48 h后即致死鸭胚、鹅胚;取尿囊液接种鸡、鸭、鹅胚等成纤维原代细胞和Vero、PK、BHK、MA-104等传代细胞,发现病毒能使成纤维细胞、Vero出现变圆、皱缩、脱落等病变;尽管PK、BHK21、MA-104等细胞接种后不出现病变,但培养上清能凝集鸡红细胞;亚型鉴定该株病毒属猪流感病毒H1N1.进行病毒对BALB/C小鼠、信鸽、8周龄仔猪的回归试验,发现该株流感病毒能使信鸽和8周龄仔猪发病;BALB/C小鼠接种病毒后临床上不表现症状,但体内产生针对该病毒的抗体.     

雏鹅新型病毒性肠炎的初步分离和鉴定

从南京某地具典型雏鹅新型病毒性肠炎病变的死亡雏鹅体内分离到一株病毒。用12日龄鹅胚增殖病毒,通过电镜观察到腺病毒样粒子,直径70-120 nm;经与小鹅瘟阳性血清进行中和作用后,接种鹅胚后仍出现死亡。人工感染4日龄健康易感雏鹅,引起发病和死亡,并具有典型雏鹅新型病毒性肠炎的临床症状和剖检特征。用此株病毒感染的鹅胚尿囊液制备的沉淀抗原,经琼脂扩散试验,不能与小鹅瘟病毒阳性血清发生特异性沉淀反应。     

一株鹅副粘病毒分离株的增殖最佳条件及其致病性研究

为了探讨鹅副粘病毒在鸡胚中增殖的最佳条件及其致病性,将不同血凝滴度的鹅副粘病毒分别接种于9～11日龄鸡胚尿囊腔,收获孵化36、48、60、72和84 h的鸡胚尿囊液,测定血凝滴度。结果表明将血凝价为1∶64的鹅副粘病毒稀释50倍后,接种9日龄鸡胚,37℃培养48～72 h获得的尿囊液血凝价可达1∶256～1∶512,平均尿囊液量可达9.4 mL/胚。动物试验表明增殖获得的鸡胚尿囊液具有较强的致病性,将该尿囊液接种10日龄鸡胚和颈部皮下注射21日龄非免疫雏鹅,结果接种后鸡胚于30～48 h全部死亡。雏鹅平均死亡时间为62.6 h。特征性剖检病变为脾脏肿大,有灰白色坏死点;胰脏出血,有灰白色坏死点;肠道出血,溃疡;病料分离培养的病毒液HA价高达28,能凝集鸡红细胞,并出现解凝现象。     

鹅细小病毒四平分离株VP3基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)核苷酸序列,设计并合成了1对引物,对吉林农业大学预防兽医学研究室分离鉴定的GPV四平株(SP)主要保护性抗原蛋白VP3基因进行扩增。所得到的PCR产物片段大小约1.6 kb,与预期片段大小相符。将该片段纯化后与T载体连接,转化到感受态大肠杆菌JM-109中进行克隆。对所提质粒进行快速鉴定、PCR鉴定以及限制性内切酶NheⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒,对重组质粒测序并进行核苷酸序列分析。结果表明:GPV四平株VP3基因长1 605 nt,包含了完整编码GPV VP3蛋白阅读框,且与国内GPV分离株B,GD,HG5/82相应核苷酸序列和氨基酸序列的同源性较高,分别为96.2%,96.3%,96.4%和97.4%,98.7%,98.9%。据此认为,GPV四平株VP3基因可以作为构建具有普遍应用价值的基因工程疫苗的候选基因。     

法氏囊炎病毒VP2基因高变区片段的克隆与鉴定

[目的]研究法氏囊病毒VP2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点。[方法]以接种传染性法氏囊病毒(IBDV)的鸡胚尿囊液为模板,根据Genbank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的全序列设计引物,通过RT-PCR扩增获得VP2高变区部分片段,将其克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1中,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)BL21,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增获得一个504bp的扩增片段,序列分析结果表明它与GenBank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的核苷酸序列同源性达99.8%,其氨基酸序列的同源性为99.4%,说明各毒株间高变区基因序列保守性很高。[结论]法氏囊炎病毒毒株在两个大小亲水区内的氨基酸都非常保守。     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株的分离与鉴定

【目的】分离鸡传染性支气管炎病毒河南地方株,并对其进行鉴定。【方法】采用鸡胚盲传,观察病毒对鸡胚的致病作用;通过酶处理、病毒干扰试验、动物回归试验、理化试验等研究病毒的特性;利用电镜观察病毒的形态,应用RT-PCR方法扩增分离毒株的S1和N基因片段。【结果】病毒盲传至第2代后鸡胚出现死亡和侏儒胚,将病毒盲传至第8代时,病毒的毒力逐渐由104.0增强到107.2;经质量分数1%胰酶处理或用磷酸酯酶C处理的病毒液能够明显凝集质量分数1%鸡红细胞,血凝滴度分别在29和27左右;病毒能够干扰NDV在鸡胚中的增殖,单独接种分离毒株的尿囊液HA滴度平均为20,先接种HN99毒株再接种NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为23,同时接种HN99毒株和NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为28.5,单独接种NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为29;病毒可致SPF雏鸡发病,引起肾脏肿大、花斑肾、尿酸盐沉积等肾脏病变;该毒株对乙醚和氯仿敏感,耐酸不耐碱,对热敏感;病毒粒子直径90~105 nm;扩增到了分离毒株S1基因片段大小为1 739 bp(含前导序列),N基因全长为1 230 bp,通过与其他IBV毒株进行系统进化分析,证明分离毒株与其他毒株的亲缘关系较远。【结论】初步证实分离的病毒为肾型鸡传染性支气管炎病毒,命名为HN99株。     

番鸭细小病毒M91G27株VP3基因的克隆与序列测定

利用 PCR技术 ,从纯化番鸭细小病毒 M91 G2 7毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒结构多肽 VP3基因。将该 PCR扩增片段克隆入 p UC1 8质粒载体的 H inc 和 Sac 位点之间 ,酶切分析筛选到含 1 .6kb基因片段的重组质粒 MP1 3。结果表明 :该片段与国外已报道毒株核苷酸序列有 98.8%的同源性 ,氨基酸序列有 98.1 %的同源性 ,证明该重组质粒是 VP3基因的克隆。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

通过鸡胚接种盲传,从重庆某地疑似鸡肾型传染性支气管炎的发病鸡群中,分离到一株病毒,该病毒能导致鸡胚出现侏儒胚。用此病毒回归10日龄雏鸡,可使试验鸡出现典型的花斑肾。尿囊液毒穴36～48h雪经差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心纯化,在电镜下能观察到典型的冠状病毒形态,病毒粒子直径为80～120nm,有囊膜、纤突。应用反转录-聚合酶链式反应穴RT-PCR雪技术扩增出了该病毒的特异性基因M和N,这从分子水平进一步证实引起鸡群死亡的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。     

鹅细小病毒于番鸭成纤维细胞上的适应性研究

为进一步了解鹅细小病毒（GPV）在番鸭成纤维细胞（MDEF）上的适应性及病毒增殖情况,将GPV在MDEF上连续传12代培养,通过PCR、免疫荧光、流式细胞等方法分析其生物学特性。PCR检测结果显示,扩增到大小为734bp的非结构蛋白基因片段,将10倍梯度稀释的病毒悬液接种细胞培养65h后,10-6倍接种的细胞仍能检测到病毒核酸。免疫荧光检测显示,兔抗GPV阳性血清能对染毒的病灶产生特异性荧光染色。流式细胞试验结果进一步证实,GPV在MDEF上增殖速度比较慢,病毒的感染会造成MDEF的早期凋亡。说明该GPV株感染MDEF后虽未产生细胞病变,但病毒能在MDEF中增殖,为GPV开展细胞依赖性相关研究奠定基础。     

H9亚型禽流感病毒NJ01株动物回归试验前后生物学特性比较

将鸭源H9亚型禽流感毒株NJ01在SPF鸡胚上所传第四代（E4）,经静脉注射回归8日龄非免疫樱桃谷鸭,取死亡鸭肺组织作为病毒重分离材料,接种SPF鸡胚,收获24～96h死亡鸡胚尿囊液,混合为F1,取F1,按上述方法再次进行回归试验并分离病毒,收获的病毒液记为F2,取E4、F1及F2病毒液,对其生物学特性进行了比较研究。研究结果表明：F2较E4对鸡胚的敏感性增强,其MDT／MLD值减小,对44日龄非免疫樱桃谷鸭静脉攻击的感染性增强,以10^8.5ELD50／羽的剂量攻毒后1d＋2d喉拭子的病毒重分离阳性率由3／5增至4／5。     

鸭瘟病毒提纯方法比较

将鸭瘟病毒CHv株经鸭胚和鸭胚成纤维细胞(DEF)进行培养增殖后,收集病毒液,分别采用沉淀法、层析法、差速离心法和蔗糖不连续密度梯度离心法进行了鸭瘟病毒的提纯研究,结果表明,DEF增殖与蔗糖不连续密度梯度超速离心法是鸭瘟病毒较好的增殖和提纯方法,病毒粒子主要存在于400～500g·L-1蔗糖层上;经20g·L-1磷钨酸负染后电镜观察发现,提纯病毒具典型疱疹病毒特征,大小较一致,为170～190nm,由核芯、衣壳和囊膜3部分组成结构较完整的病毒粒子;采用Bradford法测定,纯化病毒液中病毒含量为0.71mg·mL-1.     

猪伪狂犬病毒的增殖、纯化和鉴定

以伪狂犬病毒(PRV)活疫苗Bartha弱毒株接种于幼仓鼠肾细胞(BHK-21)使其增殖,通过PCR方法鉴定了病毒。以组织细胞半数感染剂量(TCID50)对病毒效价进行了评定,利用蔗糖密度梯度离心法纯化了病毒。结果表明,培养的病毒滴度为103.25TCID50/mL,纯化后的病毒经SDS-PAGE电泳显示,获得了较纯的蛋白条带。     

鹅细小病毒辽宁株主要结构蛋白基因的克隆及遗传进化分析

根据GenBank登陆的鹅细小病毒B株全基因组的核苷酸序列.设计合成一对引物.用PCR方法对GPV LN-1/06株的主要结构蛋白基因进行克隆,并对克隆的片段进行序列测定,用生物信息学软件进行序列分析.结果表明:所扩增的GPV LN-1/06株的基因长度为1605bp,包括VP3完整的开放阅读框,共编码534个氨基酸.与登录的20株国内和国外的GPV的VP3基因序列进行同源性分析表明,GPV LN-1/06株与其他20株VP3基因的核苷酸同源性较高,从93%至99%,说明GPV的VP3基因较为保守.系统进化树分析表明GPV-LN01/06病毒株与HG5/82为一组,具有较近的亲缘关系.本试验首次获得辽宁地区鹅细小病毒流行株的主要结构蛋白基因(VP3)的核苷酸序列,为研究国内外GPV的遗传演化规律提供参考资料.