鸡源p53单克隆抗体的制备和鉴定

转录因子p53广泛参与调节机体生理和病理过程,包括生长发育、新陈代谢、免疫应答、肿瘤发生、发展等,但是禽类p53的生物学功能尚不清楚。本研究扩增鸡p53基因并连入p ET-30a原核表达载体,将载体转化至大肠杆菌BL21中,利用IPTG诱导表达p53蛋白。经SDS-PAGE分离,收集p53蛋白并免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,利用免疫印记、间接免疫荧光和酶联免疫吸附法筛选阳性细胞株。共获得6株稳定分泌鸡p53蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D7、3C4、4D4、4F6、4F7和4H2,均为Ig G亚类,并鉴定了1D7的特异性。本研究成功实现了鸡源p53蛋白的重组表达,制备出特异性较好的抗体,为研究p53在鸡体内的生物学作用奠定了基础。     

非洲猪瘟自然弱毒株演变进程

自2018年非洲猪瘟(African swine fever,ASF)传入中国以来疫情得到了有效控制。但2021年以后,我国的ASF流行情况出现了新的变化,临床中出现了“自然变异株”。这些毒株可能导致感染后临床症状不典型,容易与其他疫病混淆等问题。这与国外的流行演变规律一致,即当ASF在一个国家或地区流行较长时间后,其临床表现将由急性发病转变为缓慢发病或出现新的临床表现。经过多年的观察积累,国外已经对该病毒的流行规律特别是自然弱毒株的演变进程有了大量记载,但国内目前尚无这方面的描述。为此,就ASF自然弱毒株的演变进程进行综述,从而提出加强血清学诊断产品研发、加快产业化报批进程、适时开展血清学监测追溯等建议,以期为我国ASF科学防控提供参考。     

非洲猪瘟病毒与宿主细胞相互作用研究进展

非洲猪瘟(ASF)自2018年8月在我国暴发,对养猪业构成巨大威胁.该病是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的家养猪高热、急性和高死亡率的出血症和淋巴组织坏死症;认识和了解病原ASFV与宿主的相互作用是理解致病机制的基础和疫病防控的前提.本文对ASFV与宿主细胞受体和内体系统的互作、基因转录和蛋白合成系统的互作、细胞凋亡和内质网应激系统的互作、天然免疫干扰素应答系统的互作、抗原递呈细胞的互作五个方面现有研究进展进行综述;并试图在此基础上理解ASFV的免疫保护和免疫逃逸作用,思考ASFV与宿主互作中需要回答的问题,为研制保护性疫苗和深入认识ASF致病机制提供线索.     

两性霉素B对猪流行性腹泻病毒入胞的抑制作用研究

通过测定两性霉素B(amphotericin B,AmpB)的细胞毒性、半数抑制浓度以及利用Western blot、间接免疫荧光、空斑形成、内吞等试验方法探究AmpB对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的抑制作用及其分子机制。结果显示：20μmol/L浓度范围内,AmpB对Vero-E6和Marc145细胞毒性极低;在Vero-E6细胞,AmpB对PEDV HLJBY和CV777毒株的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为0.5和0.3μmol/L,在Marc145细胞,AmpB对HLJBY和CV777的IC₅₀均为0.3μmol/L;AmpB处理几乎能阻断病毒感染细胞;AmpB主要抑制PEDV入胞和细胞巨胞饮作用。本研究为研制抑制PEDV或广谱抑制冠状病毒药物提供了新线索。     

ATP5J促进猪繁殖与呼吸综合征病毒复制研究

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)复制与细胞调控酶ATP5J的关系,本研究首先对猪源ATP5J基因进行了抗原表位分析,选取并合成了3段抗原小肽,制备ATP5J的多克隆的抗体。用制备的多抗检测了ATP5J质粒在293T细胞中过表达的情况。然后,用PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs),利用qPCR和Western blot检测PRRSV感染对PAM细胞中ATP5J表达的影响。最后,我们通过小RNA干扰以及过表达ATP5J,使用qPCR和Western blot技术,在PAM和Marc-145细胞上检测ATP5J变化对PRRSV复制增殖的影响。结果显示:PRRSV感染能够导致宿主细胞ATP5J蛋白表达下调;ATP5J下调时,PRRSV复制减弱;ATP5J过表达时,PRRSV复制增强,说明ATP5J能够促进PRRSV复制增殖。进一步分析证明:ATP5J促进PRRSV复制功能没有剂量依赖性。综上,PRRSV感染能够导致宿主细胞ATP5J蛋白表达下调,而ATP5J具有促进PRRSV复制的作用。该研究为阐明PRRSV与宿主相互作用提供了新思路,为解析PRRSV免疫抑制和免疫逃逸机制奠定了基础。     

马立克病病毒致瘤蛋白Meq转录调节鸡p21基因的表达

为研究马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)致瘤蛋白Meq对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21表达的调节作用,采用RTPCR、Western blot方法检测Meq蛋白表达在鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)中对p21 mRNA和蛋白水平的影响。然后,构建p21启动子的荧光素酶报告载体,检测Meq蛋白对p21的启动子活性的影响。最后,分别用MDV Md5强毒株和CVI988/Rispens疫苗毒株感染CEF细胞,利用Western blot检测MDV感染后p21蛋白水平的变化。结果:过表达Meq上调p21的mRNA和蛋白表达水平,Meq能够激活p21基因启动子活性,MDV感染细胞中p21蛋白的表达水平也有明显升高。这些发现为了解Meq在MDV感染中的作用机理奠定了基础。     

猪源干扰素刺激基因PPBP荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据猪源干扰素刺激基因PPBP(pro-platelet basic protein)基因全长序列,使用引物设计软件Primer Premier5.0设计合成特异性引物,经过PCR扩增,将基因扩增的片段连接到相应的载体上,成功构建重组质粒p3XFLAG-CMV-7.1-PPBP。重组质粒经过筛选、鉴定以及纯化后,经10倍系列稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中PPBP标准曲线的构建,并检测重复性、灵敏性和特异性。结果显示标准曲线线性关系R20.99;特异性试验中也能检测到PPBP扩增曲线;组间和组内变异系数均小于5%。使用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测PRRSV感染组织和未感染组织中PPBP的表达情况,能够检测出组织中PPBP的含量存在差异。本研究初步建立了检测猪PPBP基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为后续猪传染性疾病和猪PPBP之间相互关系的研究提供一个特异灵敏的检测和手段。     

小反刍兽疫病毒液相芯片检测方法的建立及初步应用

为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)液相芯片检测方法,根据Gen Bank上公布的PPRV的N蛋白基因序列高度保守区设计引物与探针;对探针进行C12臂修饰后与荧光编码微球偶联,将偶联后的探针与PPRV的PCR产物进行杂交,在Bio-Plex系统上读取荧光信号,建立了小反刍兽疫病毒液相芯片检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行了研究,最终用建立的方法对临床样本进行检测。结果显示,该方法只与PPRV基因的PCR产物反应,而不与其他病毒基因反应,可检出的最低基因拷贝数为5. 78×104copies/m L,表明该方法具有良好的特异性与敏感性。利用该方法对25份临床样本进行检测,共检出阳性样本15份,与传统PCR方法检测结果一致。本研究建立了小反刍兽疫病毒的快速液相芯片检测方法,为进一步建立多种外来动物疫病的液相芯片检测方法奠定了基础。     

兔出血症病毒1、2型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立和应用

兔出血症(rabbit hemorrhagic disease, RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病。RHDV属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus)。目前兔出血症病毒1型(GI.1)和兔出血症病毒2型(GI.2)2种基因型均有在我国流行。为了更好地进行流行病学调查、实时监测兔出血症发展趋势和临床诊断，建立了一种检测RHDV1型和RHDV2型病原的快速、简单、特异且敏感的TaqMan实时PCR。结果显示，稀释度为1×10⁸～1×10⁴ copies/μL标准品建立的标准曲线有良好的线性关系，决定系数r²为0.999;该方法对RHDV1型和RHDV2型具有高度特异性，与兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌等其他病原没有任何交叉反应；检测灵敏度为100～1 000 copies/μL;组内和组间变异系数在0.01%～1.61%之间。用该方法对60份...     

奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药物敏感试验

为了解2016年春夏季安徽某奶牛场奶牛乳房炎的病原菌及主要致病菌的耐药性情况,采用PCR方法对奶牛场74份乳房炎病牛奶样及30份垫料样品中分离的菌落进行鉴定。结果显示:分离得到4种致病菌,共计147株,其中大肠杆菌108株,金黄色葡萄球菌8株,乳房链球菌29株,停乳链球菌2株;药敏试验显示,青霉素、阿莫西林和庆大霉素对引起该奶牛场的4种病原菌有较好的抑制作用。