PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。     

猪Delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均是能引起仔猪腹泻的冠状病毒,通过临床症状和剖检很难鉴别诊断,建立同时检测且能够鉴别诊断这3种疾病的快速检测方法对于临床诊断具有重要的意义。参照GenBank中登录的PDCoV,NPEDV M和TGEV N基因的基因序列,利用Primer5.0设计合成3对能扩增特异性目的片段的引物,构建重组质粒,并对RT-PCR反应条件进行优化,建立了检测PDCoV,PEDV和TGEV的多重RT-PCR诊断方法,并对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性分析。利用该方法对河南176份临床样品进行检测,并与普通RT-PCR检测方法对该检测方法进行比较分析。结果表明,所建立的三重RT-PCR方法对PDCoV的最低检测量是3.14×103拷贝/μL;PEDV的最低检测量是3.88×104拷贝/μL和TGEV的最低检测量是3.68×104拷贝/μL。所建立的方法具有较好的特异性,对猪博卡病毒(PboV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟(CSFV)和猪圆环病毒(PCV)等猪常见病毒的扩增结果均为阴性。应用所建立的三重RT-PCR方法对176份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV,PDCoV和TGEV检测,并将检测结果和单重RT-PCR检测方法比较,结果显示,多重RT-PCR检测结果与常规单一RT-PCR的结果符合率均为100%。综上,本试验建立了能同时检测PDCoV,PEDV和TGEV的三重RT-PCR方法,为临床上这3种疫病的快速检测和流行病学调查奠定了基础。     

四重荧光qRT-PCR检测猪腹泻相关病毒方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪delta冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus,PDCoV)和猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)的四重荧光qRT-PCR检测方法,本研究以PEDV的N基因、TGEV的S基因、PDCoV的M基因和PTV基因组5'非编码基因为检测对象,建立同时检测4种病毒的荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法可以特异扩增4种病毒的基因,不能扩增猪呼吸道冠状病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的基因;PEDV、TGEV、PDCoV和PTV的最低核酸检出量分别为141、68、8和11拷贝数;对100份送检样品进行检测,其中PEDV、TGEV、PDCoV和PTV感染检出率分别为10%、6%、2%和55%。结果表明本研究建立的检测方法具有良好的特异性和敏感性,而且操作快速简便,可用于猪腹泻疫病的临床诊断和流行病学调查。     

PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪轮状病毒（PRoV）的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒（CSFV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出限分别为1.41×10³、1.41×10²和1.41×10³拷贝/μL;在相同条件下重复试验可获得一致的结果。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

一步法多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒方法的建立和应用

根椐Gen Bank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PARV)基因序列,分别设计3对引物,在建立各病毒单项一步法RT-PCR技术的基础上,优化多重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的一步法多重RT-PCR检测方法,用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV和PARV核酸模板进行多重RT-PCR扩增,结果可同时扩增PEDV的450 bp、TGEV的609 bp、PARV的241 bp特异性片段,而对其它4种病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR技术能检出10 pg的PEDV、10 pg的TGEV和1 pg的PARV模板。用67份临床病料对建立的多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立

猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)已经成为养猪行业的主要疫病。建立能够同时检测且能区分这2种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PEDV和PDCoV基因序列,分别用PDCoV M基因和PEDV M基因设计了2对引物,并对PEDV的M基因片段和PDCoV的M基因片段进行扩增,通过对PCR反应条件的优化,建立了检测PDCoV和PEDV双重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法。特异性和敏感度的试验表明,此方法对PDCoV和PEDV核酸的最低检测量分别为3.27×10~3拷贝/μL和3.63×10~4拷贝/μL,具有较高的敏感度;该方法可同时扩增出340 bp(PDCoV)和520 bp(PEDV),但不能扩增出猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪博卡病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。多重PCR与单一PCR符合率100%。表明此方法可以用于PDCoV和PEDV的检测。     

猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用

本试验旨在建立能同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(GAR)的多重RT-PCR检测方法。根据GenBank收录的PEDVM基因、TGEVN基因、GARVP7基因,利用软件Pri mer 5.0设计合成能分别特异性扩增PEDV、TGEV、GAR相应基因的引物。利用这3对引物,作者建立了一种新的能够同时检测PEDV、TGEV和GAR的多重RT-PCR方法,并将这种方法和常规的RT-PCR进行了比较。实验室检测中,多重RT-PCR检测方法能够检测到35 pg的TGEV-PEDV-GAR三联苗的混合RNA。应用该方法检测了华中地区75份腹泻猪粪样,同时利用常规RT-PCR检测方法对该检测方法的敏感性和特异性进行了分析,结果表明该方法检测PEDV、TGEV、GAR的敏感性分别为92%、100%、100%,特异性均为100%。该方法敏感性高、特异性强,是一种新的检测PEDV、TGEV和GAR的方法。     

4种猪腹泻病毒恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒，本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针，经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件，建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示该方法特异性强，对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为10²、10²、10³、10³ TCID₅₀/mL,并具有良好的组内和组间重复性；而荧光定量PCR方法的检测下限分别为10¹、10²、10²、10^2<...     

新发猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)是一种新发现的仔猪腹泻类冠状病毒,感染仔猪主要表现出水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状,和猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)临床症状极其类似,且临床上混合感染病例较多,单靠临床症状和剖检变化很难辨别这2种疾病,因此建立同时检测且能区分PDCoV和PEDV的检测方法具有重要意义。参照GenBank登录的PDCoV M基因和PEDV ORF3基因特异性序列设计引物,扩增相应的基因片段,克隆构建重组质粒pMD-18T-PDCoV-M与pMD-18T-PEDV-ORF3,测序验证后,分别以此重组质粒为标准品,建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,并对其扩增体系和扩增条件等进行了优化,同时对所建立的双重荧光RT-PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行了检测。结果显示,该试验成功建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28.6拷贝/μL和99.6拷贝/μL的质粒浓度,显示出较好的敏感性;在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性;特异性试验表明,该方法仅能检测出PEDV和PDCoV,而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)等均不产生特异性扩增曲线。将所建立的双重荧光RT-PCR方法以及单重荧光定量RT-PCR方法分别对198份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PDCoV检测,结果显示,PDCoV阳性样品41份,阳性率为20.7%;PEDV阳性样品59份,阳性率为29.8%;同时感染这2种病毒的样品17份,阳性率为8.6%。与单重荧光定量RT-PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样,符合率100.0%。本研究成功建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT-PCR方法,能同时准确地检测PDCoV和PEDV,这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定基础。     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得到3条与试验设计相符的1 060bp(TGEV)、462bp(PEDV)及258bp(PBoV)特异性条带,建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法。结果表明,在同一PCR反应体系中,可以同时检测这3种病毒核酸片段,而对其他病毒的检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法的最低检测限分别为35、20、10pg的核酸。采用该方法对60份临床样品进行检测,TEGV阳性率为1.6%,PEDV阳性率为6.7%,PBoV阳性率为21.7%,表明建立的方法可以应用于临床检测。     

猪主要腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)N基因的序列，分别设计相应的引物，构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品，通过优化反应条件和反应程序，建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示，该方法具有较高的灵敏性，对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×10²,1.44×10²,1.51×10²和1.56×10²拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)、猪瘟病...     

猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A型轮状病毒多重RT-PCR方法的建立及其应用

为了建立一种能够同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(RVA)的敏感、特异的多重RT-PCR(mRT-PCR)方法,本试验分别针对PEDV和TGEV的N基因、RVA的VP7基因设计了4对引物(其中针对PEDV N基因的引物为内、外2对),结合mRT-PCR和PEDV的套式RT-PCR(nRTPCR),建立了检测PEDV、TGEV和RVA的mRT-PCR方法。mRT-PCR能够同时扩增出针对3种病毒的预期大小的目的核苷酸片段,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒及猪圆环病毒2型等病毒无交叉反应;可以检测到PEDV、TGEV和RVA的最低核酸浓度分别为16.07、803.9和321.5μg/L。应用mRT-PCR检测了31份腹泻仔猪的血清、肛拭子或小肠组织,其中PEDV、TGEV与RVA的阳性率分别为61.29%、6.45%和25.81%,并检测到了PEDV与RVA或TGEV双重感染及PEDV、TGEV和RVA三重感染的样品。在检测临床样品时,mRT-PCR和单项RT-PCR检出PEDV、TGEV和RVA的符合率分别为96.77%、93.54%和93.54%。上述结果表明,mRTPCR能够快速鉴别检测PEDV、TGEV和RVA 3种病毒,PEDV是引起当前仔猪腹泻的主要病原。     

PEDV、TGEV、PoRV和PKV多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV),根据PEDV的M基因、TGEV的N基因、PoRV的VP6基因和PKV的3D基因序列设计4对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测4种病毒的RT-PCR诊断方法,该方法可特异性扩增这4种病毒的相应片段,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)均无扩增,最低检出量分别为1.33×10^4、1.33×10^3、1.33×10^4、1.33×10^5copies/μL。应用该方法对临床55份猪腹泻样品进行检测,结果检测出14份PEDV、1份PoRV和27份PKV,未检出TGEV,其中PEDV和PKV混合感染9份。上述结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于以上4种腹泻病毒的临床检测和流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎与流行性腹泻病毒二重RT-PCR 检测方法的建立及应用

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的TGEV核蛋白(N)基因和PEDV膜蛋白(M)基因保守区域序列分别设计了1对特异性引物,以TGEV和PEDV混合总RNA为反转录模板,建立了TGEV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了应用检测,并对检测到的阳性样品进行克隆测序。结果表明,成功建立了TGEV和PEDV二重RT-PCR检测方法,该方法的检测灵敏度最低极限为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增TGEV和PEDV细胞培养物,但对ST细胞和其他7种病原对照扩增不出任何条带;对22份临床疑似TGEV和PEDV感染样品检测结果与测序结果完全一致。本研究成功建立了TGEV与PEDV二重RT-PCR检测方法,可适用于猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病的快速鉴别诊断。     

同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的四重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为实现对猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)和猪流性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了一种可同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法。结果显示,所建立的四重实时荧光RT-PCR方法仅对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等猪常见病原无交叉反应;对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的最低检出限分别为1.17×10³,1.13×10³,1.31×10²和1.18×10^2<...     

猪丁型冠状病毒与猪流行性腹泻病毒双重实时荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

猪丁型冠状病毒(PDCoV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)均为致病性冠状病毒,可以引起猪呕吐、腹泻脱水和新生仔猪死亡。为了建立一种快速检测PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank登录的2种病毒基因的保守序列,设计了两对特异性引物,分别扩增其N、M基因保守区,并将其克隆至pMD19-T载体;将10倍梯度稀释的混合重组质粒作为标准品模板,建立了一种检测PDCoV和PEDV的双重的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法,并对其反应的敏感度、特异性和重复性进行了检测。结果表明,本试验所建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法对PDCoV和PEDV的最低检测量分别为51和32拷贝·μL-1,且与PBoV、TGEV、PRV、PCV2无交叉反应,特异性较好;对2016年至2017年在河北省收集的130份仔猪腹泻样本检测,结果显示,PDCoV的检出率为16.9%,PEDV的检出率为66.2%,二者同时感染的检出率为2.3%,与普通RT-PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为PDCoV和PEDV的诊断及分子流行病学调查提供了一种快速、定量检测方法。     

猪轮状病毒、猪札幌病毒和猪星状病毒三重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种同时检测猪轮状病毒(PRoV)、猪札幌病毒(PoSaV)和猪星状病毒(PAstV)的三重PCR方法,本研究参考PRoV的VP6基因、PoSaV的RdRp基因以及PAstV的ORF1基因序列分别设计特异性引物,通过特异性、敏感性、重复性试验优化反应条件,建立了快速鉴别PRoV、PoSaV和PAstV的三重PCR方法。试验表明,该方法能特异性扩增PRoV、PoSaV、PAstV的目的片段,对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)等常见猪病病毒的检测结果均为阴性,特异性良好;PRoV、PoSaV和PAstV的检测限量分别为1.38×10~2、8.33×10~2和4.40×10~3拷贝数/μL,具有较好的敏感性。利用三重PCR和单重PCR方法同时对80份规模化猪场的临床腹泻样品进行检测,结果表明,3种病毒的样品阳性率均为5.00%,2种方法的检测结果相一致。本研究成功建立了同时PRoV、PoSaV和PAstV的三重PCR检测方法,可用于三种病原感染的临床鉴别诊断。     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二重PCR检测方法的建立

通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为10⁴ 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查.     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒A多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为对引起腹泻症状的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA) 3种病毒同时快速地鉴别检测,本研究对GenBank中登录的TGEV的S基因、PEDV的S基因、PRo VA的NSP基因进行序列分析,分别设计了针对3种病毒的特异性引物和用3种荧光基团标记的核酸探针,通过条件优化建立了针对这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能够特异性检测PEDV、TGEV和PRo VA,而与其它病原无交叉反应;对TGEV、PEDV和PRo VA的最低检测量分别为1.12拷贝/μL、39拷贝/μL和25拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于5%;该方法与商品化的试剂盒检测结果符合率达100%。该方法快速、敏感,检测结果准确可靠,为猪病毒性腹泻疾病的流行病学调查和分子生物学快速诊断奠定了基础。