猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

猪Delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均是能引起仔猪腹泻的冠状病毒,通过临床症状和剖检很难鉴别诊断,建立同时检测且能够鉴别诊断这3种疾病的快速检测方法对于临床诊断具有重要的意义。参照GenBank中登录的PDCoV,NPEDV M和TGEV N基因的基因序列,利用Primer5.0设计合成3对能扩增特异性目的片段的引物,构建重组质粒,并对RT-PCR反应条件进行优化,建立了检测PDCoV,PEDV和TGEV的多重RT-PCR诊断方法,并对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性分析。利用该方法对河南176份临床样品进行检测,并与普通RT-PCR检测方法对该检测方法进行比较分析。结果表明,所建立的三重RT-PCR方法对PDCoV的最低检测量是3.14×103拷贝/μL;PEDV的最低检测量是3.88×104拷贝/μL和TGEV的最低检测量是3.68×104拷贝/μL。所建立的方法具有较好的特异性,对猪博卡病毒(PboV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟(CSFV)和猪圆环病毒(PCV)等猪常见病毒的扩增结果均为阴性。应用所建立的三重RT-PCR方法对176份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV,PDCoV和TGEV检测,并将检测结果和单重RT-PCR检测方法比较,结果显示,多重RT-PCR检测结果与常规单一RT-PCR的结果符合率均为100%。综上,本试验建立了能同时检测PDCoV,PEDV和TGEV的三重RT-PCR方法,为临床上这3种疫病的快速检测和流行病学调查奠定了基础。     

PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。     

新发猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)是一种新发现的仔猪腹泻类冠状病毒,感染仔猪主要表现出水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状,和猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)临床症状极其类似,且临床上混合感染病例较多,单靠临床症状和剖检变化很难辨别这2种疾病,因此建立同时检测且能区分PDCoV和PEDV的检测方法具有重要意义。参照GenBank登录的PDCoV M基因和PEDV ORF3基因特异性序列设计引物,扩增相应的基因片段,克隆构建重组质粒pMD-18T-PDCoV-M与pMD-18T-PEDV-ORF3,测序验证后,分别以此重组质粒为标准品,建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,并对其扩增体系和扩增条件等进行了优化,同时对所建立的双重荧光RT-PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行了检测。结果显示,该试验成功建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28.6拷贝/μL和99.6拷贝/μL的质粒浓度,显示出较好的敏感性;在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性;特异性试验表明,该方法仅能检测出PEDV和PDCoV,而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)等均不产生特异性扩增曲线。将所建立的双重荧光RT-PCR方法以及单重荧光定量RT-PCR方法分别对198份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PDCoV检测,结果显示,PDCoV阳性样品41份,阳性率为20.7%;PEDV阳性样品59份,阳性率为29.8%;同时感染这2种病毒的样品17份,阳性率为8.6%。与单重荧光定量RT-PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样,符合率100.0%。本研究成功建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT-PCR方法,能同时准确地检测PDCoV和PEDV,这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定基础。     

猪Delta冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒多重PCR检测方法的建立和应用

旨在建立快速准确检测与猪腹泻相关的猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)多重PCR检测方法。针对PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计了4对特异性引物,分别扩增PDCoV N基因(447 bp)、PEDV M基因(204 bp)、TGEV M基因(612 bp)、PRoV VP6基因(329 bp),经过对反应条件的优化,成功建立了能同时特异性检测PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR,且特异性好。应用该检测方法对上海及周边地区养殖场临床猪腹泻病料进行检测,结果检出PEDV阳性样品16份,其中PEDV和TGEV混合感染1份,PDCoV和PRoV均未检出,与单一RT-PCR检测结果完全吻合。该快速检测方法的成功建立,将有助于提高对PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的病原学调查和疾病监测,为生态养殖提供技术储备。     

猪主要腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)N基因的序列，分别设计相应的引物，构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品，通过优化反应条件和反应程序，建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示，该方法具有较高的灵敏性，对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×10²,1.44×10²,1.51×10²和1.56×10²拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)、猪瘟病...     

猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据Gen Bank登录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）毒株（登录号KJ960180）的M基因保守序列,设计1对扩增片段大小为299 bp的特异性引物,经PCR扩增、克隆、测序鉴定后,提取质粒作为阳性标准品,建立了PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法在1.21×10^3~1.21×10^8拷贝/μL范围内呈现良好的线性,相关系数（R2）为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线为单个特异峰,产物Tm值为85.5~86℃,最低检测限为1.21×10^1拷贝/μL。本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、成本低且操作简单,适用于PEDV的早期诊断、定量研究和流行病学监测。     

三种猪的肠道腹泻冠状病毒三重RT-PCR检测方法的建立与应用

为了同时检测引起猪只腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)和猪急性腹泻冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)这三种主要肠道冠状病毒,试验设计3对特异性引物,建立PEDV、PDCoV和SADS-CoV的三重RT-PCR方法,同时进行特异性、敏感性、重复性试验,并检测临床样品对方法进行验证。结果表明:采用建立的三重RT-PCR方法对PEDV、PDCoV和SADS-CoV进行扩增,分别扩增出大小约为486 bp、329 bp和628 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪传染性肠胃炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒不能扩增出任何片段,特异性好;对PDCoV、PEDV和SADS-CoV的最低检测量分别为1×10~6,1×10~3,1×10~4 copies/μL,具有较好的敏感性;在196份临床样品中,PEDV的阳性检出率为13.27%,PDCoV为12.24%,SADS-CoV为0,同时多重RT-PCR与单项RT-PCR检测方法的符合率均为100%。说明建立的三重RT-PCR方法能够同时特异敏感、高效廉价检测出猪群中PDCoV、PEDV及SADS-CoV这三种肠道冠状病毒,具有快速、便捷和经济的特性,可用于临床大规模流行病学调查和诊断。     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二重PCR检测方法的建立

通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为10⁴ 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查.     

PEDV、TGEV和PoRV三重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、敏感的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)三重PCR检测方法,根据GenBank登录的PEDV S基因、TGEV M基因和PoRV VP7基因参考序列,设计3对特异性引物,以克隆的质粒为模板,进行反应条件的优化以及特异性、敏感性试验。结果采用所建立的方法能够扩增出PEDV、TGEV和PoRV特异性片段,且不能检出PCV2、CSFV、PRRSV;对PEDV、TGEV和PoRV质粒模板的最低检测量分别为1×10~2拷贝/μL、1×100拷贝μL、1×10~3拷贝/μL;对10~2份临床病料进行检测,结果 PEDV、TGEV和PoRV的检出率分别为37.25%、1.96%和6.86%,与单项PCR检测结果进行比较,符合率均为100%。结果表明,所建立的三重PCR检测方法可为猪病毒性腹泻病的快速诊断及流行病学调查提供技术支持。     

Porcine Circovirus Type 2 and Porcine Circovirus-Associated Disease

Porcine circovirus type 2 (PCV2) belongs to the viral family Circoviridae and to the genus Circovirus . Circoviruses are small, single-stranded nonenveloped DNA viruses that have an unsegmented circular genome. PCV2 is the primary causative agent of several syndromes collectively known as porcine circovirus-associated disease (PCVAD). Many of the syndromes associated with PCVAD are a result of coinfection with PCV2 virus and other agents such as Mycoplasma and porcine reproductive and respiratory syndrome virus. PCV2 infection is present in every major swine-producing country in the world, and the number of identified cases of PCVAD is rapidly increasing. In the United States, the disease has cost producers an average of 3–4 dollars per pig with peak losses ranging up to 20 dollars per pig. The importance of this disease has stimulated investigations aimed at identifying risk factors associated with infection and minimizing these risks through modified management practices and development of vaccination strategies. This paper provides an overview of current knowledge relating to PCV2 and PCVAD with an emphasis on information relevant to the swine veterinarian.     

猪圆环病毒病

现已确认猪圆环病毒病(PCVD)发生于全世界,对养猪业带来了严重的经济损失。尽管最近全世界许多实验室对此病进行的研究使我们获得了大量的有关知识,但我们对其病程的了解仍有重要缺陷,因而仍然无法对其进行有效防制。     

猪圆环病毒病的防控

猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属,为环状、单股DNA病毒,含1767-1768个核苷酸,是动物病毒中最小的一员.圆环病毒分1型和2型,其中2型(PCV2)致病性明显大于1型,临床表现的相关性疫病主要由2型引起.