副猪嗜血杆菌Apd-ELISA抗体检测试剂盒的制备和初步应用

旨在对副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）的黏附素蛋白（autotransporter passenger domain,Apd）ELISA抗体检测方法进行参数优化、临界值确定和应用评价,获得性能稳定的副猪嗜血杆菌病抗体检测试剂盒。首先通过猪的免疫攻毒试验获得HPS阴、阳性对照血清,优化Apd-ELISA的反应参数;然后用背景确认的阴、阳性血清确定其临界值,并对封闭液及酶标板的包装方式进行选择;最后用Apd-ELISA试剂盒对临床样品进行检测并与荷兰Biocheck的OppA-ELISA试剂盒进行比较。结果表明,抗原包被质量浓度为0.5 μg·mL^-1、被检血清以1：200倍稀释后反应45 min以及二抗稀释度为1：15 000时,Apd-ELISA的反应背景下降,区分度提高。根据背景确认的27份阳性和40份阴性血清的OD_{630 nm}值以及临界值计算公式（S-N）/（P-N）,得到Apd-ELISA的阴阳性临界值是0.33。证实用封闭液K封闭和真空包装的酶标板可以在50℃保存4 d（相当于在4℃保存22个月）。用Apd-ELISA试剂盒检测1 179份临床血清,表明母猪、后备和育肥猪以及仔猪的HPS血清阳性率分别为83.76%、61.09%和27.48%。与荷兰的Biocheck试剂盒进行比较,发现Apd-ELISA与Biocheck试剂盒（OppA-ELISA）对HPS临床阴性血清和疫苗免疫血清检测的符合率为100%,对HPS临床阳性血清的符合率仅为4.76%（6/126）。然而,Apd-ELISA与OppA Western blot的阳性符合率可达到73.02%（92/126）。本研究获得了能有效区分HPS阴、阳性血清和稳定保存的Apd-ELISA抗体检测试剂盒,可用于HPS灭活疫苗免疫后的抗体检测和副猪嗜血杆菌病的血清抗体检测。     

副猪嗜血杆菌间接ELISA检测方法的建立

为建立一种快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的血清学方法,本实验采用重组表达的HPS细胞致死膨胀毒素B亚基蛋白(r Cdt B)作为包被抗原,并对各反应条件进行优化,建立了检测HPS血清抗体的间接ELISA方法。以该方法检测HPS阳性血清和其他猪病病原阳性血清,除了HPS阳性血清呈阳性外,其余均为阴性,表明该方法特异性良好。批内重复和批间重复的最大变异系数分别小于7%和8%。此外,将Cdt B-ELISA方法与商品化试剂盒Bio Chek HPS-Opp A间接ELISA抗体检测方法对背景明确的116份HPS阳性血清和112份HPS阴性血清进行检测,商品化试剂盒阳性符合率为25%,阴性血清符合率为100%,总符合率为62%,其中Cdt B-ELISA方法对阳性血清的检出率高于商品化试剂盒。应用Cdt B-ELISA方法检测330份临床猪血清样品,结果显示,HPS抗体阳性检出率为11.8%。该方法可以用于HPS的临床检测,为HPS流行病学调查和防控提供了一种快速有效的检测方法。     

基于外膜蛋白Omp16的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测副猪嗜血杆菌(H.parasuis)抗体方法,本研究以H.parasuis外膜蛋白Omp16为包被抗原建立了检测H.parasuis的间接ELISA方法。反应条件经优化为:抗原包被浓度为1μg/m L,血清稀释度为1:80;血清与抗原最佳作用时间为40 min,二抗稀释10 000倍,与一抗孵育30 min;TMB作用时间为30 min。利用该ELISA方法检测H.parasuis、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌和猪链球菌2型等血清,除H.parasuis为阳性外其余均为阴性,表明其特异性强。该ELISA方法可检测到最高稀释度为1∶512的阳性血清,敏感性高。重复性试验显示,其批内和批间的重复试验变异系数(CV)分别在3.62%~8.97%和4.3%~9.50%。该ELISA检测方法与进口ELISA试剂盒的阳性符合率、阴性符合率和总体符合率分别为87.8%,90.7%和88.6%。本研究建立的间接ELISA方法,为H.parasuis血清流行病学调查及疫苗免疫评价等提供了重要手段。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

本试验采用121 ℃高压处理副猪嗜血杆菌4型和5型耐热蛋白,混合作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度为10 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液选择含20 g/L脱脂奶粉的PBST,封闭30 min;血清的稀释度为1∶80;抗原抗体反应时间为45 min;酶标二抗稀释度为1∶12000,作用时间为30 min;底物显色时间为15 min。特异性、重复性和敏感性试验及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,对已知阴阳性血清的临床样本检测结果与国外ELISA试剂盒一致,可用于副猪嗜血杆菌的血清抗体检测和血清流行病学调查。     

猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

以原核表达、纯化的猪瘟病毒(CSFV)E2主要抗原区蛋白为目标检测物,通过对各反应条件的筛选和优化,建立了检测CSFV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,本研究的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度分别为1.0 μg/mL和1:200;最佳抗原包被条件和最佳封闭时间均为37 ℃ 1 h;最佳酶标二抗稀释度和作用时间分别为1:10 000和37 ℃ 45 min;阴性临界值判断标准为当D450nm<0.30时猪血清样品为CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为4.8%和6.9%,表明该检测方法具有较高的稳定性;特异性试验结果表明,间接ELISA方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清均无交叉反应;应用该间接ELISA方法随机检测80份猪血清样品,与进口阻断ELISA试剂盒相比其阳性符合率为83.58%,阴性符合率为76.92%,总体符合率为80.25%。结果表明本试验建立的间接ELISA方法具有很好的临床应用价值。     

副猪嗜血杆菌OMP P5间接ELISA抗体检测方法优化

利用副猪嗜血杆菌(HPS)OMP P5基因表达并纯化复性后蛋白作为包被蛋白,通过对最佳加样作用时间的确定和最佳酶标二抗反应时间等条件的探索优化,建立针对副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5(OMPP5)的间接ELISA抗体检测方法,通过对进行和未进行HPS免疫的健康猪血清的检测,证实了建立的间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、反应快速准确等特点,可用于HPS的快速诊断     

猪伪狂犬病病毒间接ELISA检测方法的建立

以纯化的PRV抗原为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了可检测PRV血清抗体的间接ELISA诊断方法。标定抗原的最佳包被量为0.802μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为60min,判定标准为OD 450nm值大于0.357为阳性,小于0.296为阴性,在0.296与0.357之间为可疑。该方法检测其他6种常见猪病病毒(CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、JEV、TGEV)的阳性血清均为阴性;与商品化ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为90.0%、87.1%、92.3%。本研究建立的PRV间接ELISA抗体检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV免疫猪群抗体监测、快速诊断和PR流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪戊型肝炎ELISA诊断试剂盒的研制及应用

本试验旨在建立有效的针对猪戊型肝炎病毒(HEV)的诊断技术及试剂盒。作者建立了应用猪HEVORF3筛选出来的一段序列合成肽swHEV11检测HEV血清抗体的间接ELISA诊断方法,确定的抗原最适包被浓度为3μg·mL-1;血清最适稀释度为1∶10,作用时间为30min;酶标抗体最适稀释度为1∶12000,作用时间为60min。用HEV ORF3合成肽swHEV11研制的猪HEV ELISA诊断试剂盒,与北京万泰试剂盒检测比较,符合率为73.4%(205/279),灵敏度和特异性分别为73.3%(200/273)和83.3%(5/6)。该试剂盒批内重复的变异系数10%,批间变异系数20%。结果表明,该方法的建立和所研制的猪戊型肝炎诊断试剂盒灵敏度高,特异性强,稳定性合格,为猪戊型肝炎病毒抗体的检测和流行病学的调查提供了一种简便快速的血清学诊断方法。     

副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法的建立

采用福尔马林灭活的副猪嗜血杆菌全菌体作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。经试验确定副猪嗜血杆菌全菌体的包被浓度为2·24×107CFU/孔、检测血清为1∶200稀释,同时确立了间接ELISA的最佳反应条件。该方法有很高的特异性和重复性,14个发病猪场100份血清检测结果Hps抗体阳性检出率为94%,明显高于细菌分离鉴定检测结果。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体的间接ELISA检测方法,应用原核表达的IBDV VP2蛋白作为包被抗原,经方阵试验确定间接ELISA试验的最佳反应条件：包被抗原的浓度为8 μg/mL,标准阴、阳性血清的稀释度为1:400,封闭液选用10 %马血清,酶标抗体最佳稀释倍数为1:15000,最佳抗原稀释液为0.01 M PBS(PH 7.2);抗原最佳包被条件为4 ℃过夜,待检血清和酶标二抗反应条件为37 ℃ 60 min,底物作用时间为15 min。待检血清的OD450nm≥0.288判为阳性,反之判为阴性。特异性试验、敏感性试验和重复性试验结果显示,该方法的特异性好、敏感高、重复性好。用建立的间接ELISA方法与商品化IDEXX-ELISA试剂盒对临床血清样品进行检测,符合率为93.5 %。该方法的建立为检测IBDV抗体提供了一种安全、特异、敏感、方便经济的检测方法,为鸡传染性法氏囊病免疫监测和预防控制提供了科学的技术手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV N蛋白,亲和层析纯化后作为包被抗原,通过对各反应条件优化选择,建立了PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法,并进行了交叉反应和重复性试验,以及同类成品试剂盒间的应用效果对比试验。最终确定了抗原包被最佳浓度为2 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,血清及酶标二抗孵育时间均为30 min,显色时间为10 min,检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒等5种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该ELISA检测方法批内和批间重复性的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒效果比较显示符合率为94.7%。本研究建立的间接ELISA方法将为猪群感染野毒PRRSV后的快速诊断及流行病学调查提供一种简便易行、快速高效的血清学抗体检测方法。     

基于溶菌酶释放蛋白的猪链球菌间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立猪链球菌病的快速诊断方法,本研究以纯化的原核表达的猪链球菌溶菌酶释放蛋白(MRP)为包被抗原,通过各反应条件的优化建立了检测猪链球菌(SS)血清抗体的间接ELISA方法。实验确定了最佳抗原包被浓度为0.05μg/mL、待检血清最佳稀释倍数为1:400、最佳封闭液为5%脱脂乳、兔抗猪HRP-IgG的最佳稀释倍数为1:15 000、抗体阴阳性临界值为0.226。特异性试验结果显示,利用本研究建立的ELISA方法检测100份背景清晰的阴性血清,检出其中97份阴性血清,3份阳性血清,特异性为97%。利用该ELISA方法检测副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴氏杆菌、大肠杆菌、猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清,结果显示均为阴性,而猪链球菌2型(SS2)、SS7、SS9以及SS12阳性血清的检测结果均为阳性,表明该方法具有较强的特异性。敏感性试验结果显示,利用本研究建立的ELISA方法检测50份背景明确的阳性血清,检出其中48份阳性血清,2份阴性血清,敏感性为96%。当SS2阳性血清稀释倍数达1:3 200时仍为阳性结果,表明该方法具有较高的敏感。重复性试验结果显示,该ELISA方法批内、批间最大变异系数分别为4.70%和7.20%,表明该方法的重复性较好。对100份临床猪血清样品检测结果显示,本研究建立的ELISA方法与玻片凝集试验的符合率为85.3%,符合率较高。对440份来自东北三省部分地区猪场的血清样品检测结果显示,SS抗体阳性率为27.7%(122/440)。表明,东北三省部分地区猪场SS的感染率较高。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法可以用于SS2、SS7、SS9以及SS12血清抗体的检测,为SS病的血清流行病学调查提供了可靠的技术手段。     

检测牛边缘无浆体抗体的竞争抑制ELISA方法的建立

为建立检测牛边缘无浆体(Anaplasma marginale)抗体的方法,本研究以牛A.marginale膜表面重组MSP5蛋白作为包被抗原,抗MSP5单克隆抗体(MAb)作为竞争抗体,建立一种用于检测牛A marginale抗体的重组MSP5蛋白竞争抑制ELISA(CI-ELISA)方法.经优化确定CI-ELISA的最佳反应条件为:抗原包被浓度为2μg/孔,封闭液为2%脱脂乳,MAb的稀释度为1:400,酶标二抗的稀释度为1:1000,阴性和阳性血清临界值分别为33%和40%;该方法具有良好的特异性和重复性;2 348份临床血清样品的检测结果表明,217份为阳性,阳性率为9.2%,与IDEXXA marginale抗体检测试剂盒的阳性符合率为95.3%,阴性符合率为100%.本实验建立的ELISA方法具有较高的特异性和重复性,可用于流行病学调查研究.     

猪附红细胞体病间接ELISA诊断试剂盒的研制及初步应用

以纯化的猪附红细胞体特异性抗原为包被抗原,在建立猪附红细胞体病间接ELISA检测方法的基础上对各反应参数进行了优化,并初步组装成试剂盒。组装的试剂盒抗原最佳包被质量浓度为30 mg/L,被检血清稀释度为1∶100,酶标二抗的最适工作滴度为1∶4 000,底物TMB最适反应条件为室温15 min;检测血清的判定标准为D450值≥0.13定为阳性反应,D450值≤0.11定为阴性反应,0.11~0.13定为疑似反应;该试剂盒不与猪大肠杆菌病、猪弓形虫病及猪瘟等阳性血清发生交叉反应,具有较好的特异性;在不同时间对阴阳性样品重复检测8次,阴阳性血清的D450值变异系数均未超过10%,说明该试剂盒具有良好的重复性;通过对组装试剂盒中各组分的稳定性和保存时间的测定结果证实,该试剂盒的保质期暂定为6个月;应用保存6个月的试剂盒通过对吉林省延边地区的60份猪血清样本检测,并与间接ELISA比较,其阳性符合率达100%,说明该试剂盒具有较好的稳定性。     

猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法的建立

用纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白为抗原,建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的gB-ELISA方法。最佳反应条件为：抗原包被浓度为3.15μg/mL,待检血清稀释度为1∶40。该方法对猪圆环病毒病、猪瘟、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征（猪蓝耳病）、猪乙型脑炎、猪布氏杆菌病5种疾病阳性血清和SPF猪阴性血清检测呈阴性反应。批间、批内试验变异系数均不超过8%。用该方法与HerdChek ELISA试剂盒同时对119份血清进行了平行检测,其相对敏感性、特异性和符合率分别为：75%、80.7%和79%。试验结果表明：猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性,且重复性好,可用于猪伪狂犬病毒血清抗体检测。     

布鲁菌bp26基因的表达与bp26-间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

为了研制布鲁菌bp26-间接ELISA抗体检测试剂盒,将布鲁菌bp26基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,以纯化后的重组蛋白bp26包被酶标板,优化ELISA反应条件,组装试剂盒。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,重组蛋白分子质量约为41 ku,经IPTG诱导后高效表达,且具有良好的免疫原性;优化试验确定重组抗原最佳包被浓度为3.6 μg/mL,血清样本的阳性临界值为0.370;特异性试验结果表明,重组蛋白与牛结核菌、副猪嗜血杆菌、链球菌等多种病原体的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验结果表明,血清稀释至1:12800时,仍检测为阳性;该试剂盒的批内、批间变异系数均小于10%;用该试剂盒检测241份临床牛血清样本,并与试管凝集试验(SAT)检测结果比较,两者符合率为97.1%。原核表达的布鲁菌bp26具有良好的免疫原性,研制的布鲁菌bp26-间接ELISA抗体检测试剂盒敏感性、特异性和重复性较好,可为布鲁菌基因缺失标记疫苗的应用提供配套的血清学诊断方法。     

猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌三重PCR检测方法的建立

为建立简便、快速及灵敏度高的同时对猪肺炎支原体(Mh)、多杀性巴氏杆菌(PM)和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(App)三重PCR的检测方法,本研究针对这3种病原的基因分别设计3对特异性引物,通过PCR方法分别扩增出116bp(Mh)、253bp(PM)和473bp(App)的目的片段,其最低检出量为4个拷贝;而对肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌的PCR扩增则结果均呈阴性。表明该方法具有很好的敏感性和特异性。利用该检测方法对某屠宰场472头猪肺组织病料进行检测,其结果显示:Mh、PM和App的阳性检出率分别为19.27%、5.5%和2.75%;而ELISA检测的阳性检出率分别为18%、5.08%和1.9%。这两种方法对阳性的样品检测的平均符合率为90%;此外,多重PCR与病原分离培养方法的符合率为100%。     

猪乙型脑炎病毒囊膜E蛋白间接ELISA诊断方法的建立与初步应用

本研究利用纯化的原核表达乙型脑炎囊膜E蛋白作为包被抗原,建立了乙型脑炎间接ELISA诊断方法。对检测的各种条件进行了优化,优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2μg/mL,抗原最佳包被条件为37℃包被2 h,血清的最适稀释度为1∶160,酶标抗体最适稀释度为1∶5000,最佳封闭条件为1%BSA,阴阳性临界值判定标准为D492 nm=0.254。该方法不与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒阳性血清反应,其D492 nm0.254,说明该方法具有良好的特异性。采用该方法对150份疑似乙型脑炎血清样品进行检测,结果显示,与某猪乙型脑炎试剂盒相比符合率为90.77%,表明建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,因此,本研究成功建立了能特异性检测抗乙型脑炎血清抗体的ELISA检测方法。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

采用RT-PCR方法扩增猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠埃希菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白得到成功表达。利用纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。ELISA抗原最适包被浓度为0.5μg/mL(0.05μg/孔),最佳封闭液为5g/L BSA,待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000,最适作用时间为45min,室温显色10min。用该方法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别<5%和<8%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用△E2-ELISA对350份血清样品进行检测,阳性率为77.71%,高于IDEXX试剂盒检测阳性率(67.14%),与IDEXX试剂盒阳性符合率91.06%,阴性符合率50%,总符合率77.43%。表明本试验建立的间接ELISA方法适于临床CSFV血清抗体的检测。