奶牛猝死病例中O101大肠杆菌的分离及部分毒力相关抗原的鉴定

为鉴定引起奶牛猝死综合征的病原及其毒力相关抗原,本研究无菌采集急性死亡奶牛的肝、脾、肾及小肠内容物样本,进行病原菌的分离和纯化,通过微生物学诊断、肠毒素试验、血清学试验、药敏试验和菌毛PCR进行鉴定,结果表明所分离的菌株为产ST肠毒素并具有F41菌毛、血清型为O101的大肠杆菌,该菌株对克林霉素、多黏菌素B、头孢曲松高度敏感。本实验为进行奶牛大肠杆菌性猝死综合征的防治奠定了基础。     

人工感染边缘无浆体对犊牛血清生化及血液流变学的影响

为通过人工感染的方法建立牛边缘无浆体病动物模型,研究边缘无浆体(A.marginale)感染对犊牛血液主要生化指标和血液流变学指标的影响,本实验采用地塞米松注射液长期抑制一月龄犊牛的免疫力,经颈静脉接种含有A.marginale的血液,定期采血,测定其血液主要生化指标和血液流变学指标。结果表明,感染A.marginale后,血液主要生化指标与对照组相比,谷丙转氨酶(GPT)含量极显著升高(p0.01),谷草转氨酶(GOT)含量显著升高(p0.05),血糖(GLU)含量显著降低(p0.05),总胆固醇(T-CHO)含量极显著降低(p0.01),而碱性磷酸酶(ALP)、血铁(Fe)、尿素(BUN)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBD)和肌苷(Cr)含量均无显著性变化;血液流变学主要指标与对照组相比,全血还原高切比粘度和红细胞刚性指数(IR)极显著降低(p0.01),全血中切比粘度、全血低切比粘度和全血还原低切比粘度显著降低(p0.05),全血高切比粘度、血浆比黏度(ηp)、红细胞压积(PCV)和红细胞聚集指数(AI)均无显著性变化。     

边缘无浆体病动物模型的建立及其生理指标变化规律的研究

建立边缘无浆体病的动物疾病模型。采用地塞米松注射液长期抑制实验动物的免疫力,通过犊牛颈静脉接种含有无浆体病原的牛血液,监测奶牛无浆体感染过程中其生理指标的变化趋势,以及在实验动物体内的消长规律,建立起无浆体人工感染动物模型。无浆体感染实验动物有5～7d的潜伏期,感染早期体温先升高后回复正常,呼吸先加快后回复正常水平,心率无明显变化。边缘无浆体感染过程中,红细胞出现大量变形和破碎,数量减少,白细胞呈现减少升高再减少的过程后,逐步恢复到正常水平,而血小板数量增加。因此,可用1月龄犊牛在免疫抑制情况下建立无浆体人工感染动物模型,揭示犊牛在感染边缘无浆体过程中其生理与血液指标的变化规律。     

新城疫病毒F和HN基因真核表达载体的构建

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F、HN基因序列和真核细胞表达载体pEGPF-N1的克隆位点,分别设计一对引物,通过PCR方法获得了F、HN基因,经回收纯化,将产物连接到克隆载体pMD18-T上。酶切鉴定和序列分析后,再将目的基因亚克隆到真核细胞表达载体pEGPF-N1上,经鉴定,成功构建含有NDVF和HN基因的真核细胞表达载体pEGPF-N1-F和pEGPF-N1-HN,为下一步研究NDVF和HN蛋白在细胞凋亡中的生物学功能奠定基础。     

8株牛支原体分离株P81表面膜蛋白基因的克隆与序列分析

本研究对我国采集自8个省份患有牛呼吸道疾病的肺脏组织病料进行了病原分离鉴定,得到8株牛支原体(M.bovis)分离株。参考GenBank中已发表的M.bovisPG45株的P81基因序列,设计引物扩增P81基因,将其克隆到pMD-18T上,筛选重组质粒并对其进行序列测定及分析。结果显示,P81基因全长2097bp,含有1个开放性阅读框,编码699个氨基酸。这8株M.bovis分离株的P81同源性为99.4%～99.9%,与PG45株同源性94.6%～94.9%,与无乳支原体(M.agalacia)PG2株同源性仅为73.8%～74%,结果表明,M.bovisP81基因基因高度保守,种间差异较大,具有研究前景。     

抗牛边缘无浆体MSP5单克隆抗体的制备

为制备抗牛边缘无浆体膜表面蛋白(MSP5)单克隆抗体(MAb),以原核表达的重组MSP5蛋白(rMSP5)免疫BALB/c鼠,应用常规杂交瘤技术获得2株能稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株(1D8和2F3).间接ELISA检测腹水效价分别为5.49×105和7.83×104,亚类鉴定其重链为分别为IgG2b和1gG2a,轻链均为K型;ELISA叠加试验表明这2株MAb识别的抗原位点相同或相近;Western blot结果显示2株MAb均能与rMSP5发生反应.特异性抗MSP5的MAb的获得,为牛边缘无浆体检测奠定了基础.     

牛支原体双重PCR检测方法的建立

为鉴别牛支原体(Mycoplasma bovis)与丝状支原体丝状亚种SC(M.mycoides subsp.mycoides SC),本实验通过优化M.bovis特异性引物pMB81-1/pMB81-2s和MmmSC特异性引物SC1/SC2的退火温度,建立了鉴别M.bovis和MmmSC的双重PCR检测方法。该方法能够分别由M.bovis和MmmSC扩增得到528bp和270bp片段。敏感性试验结果显示该方法检测M.bovis和MmmSC培养物的最低浓度分别为106cfu/mL和105cfu/mL。特异性试验结果显示,该方法对无乳支原体代表株PG2、丝状支原体丝状亚种LC型代表株Y-goat、山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp、绵羊支原体Y-98、猪鼻支原体BST-7、巴氏杆菌以及结核分枝杆菌扩增结果均为阴性。应用该方法对临床病料的检测结果与培养鉴定结果的符合率为100%,表明该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于临床检测。