猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

以原核表达、纯化的猪瘟病毒(CSFV)E2主要抗原区蛋白为目标检测物,通过对各反应条件的筛选和优化,建立了检测CSFV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,本研究的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度分别为1.0 μg/mL和1:200;最佳抗原包被条件和最佳封闭时间均为37 ℃ 1 h;最佳酶标二抗稀释度和作用时间分别为1:10 000和37 ℃ 45 min;阴性临界值判断标准为当D450nm<0.30时猪血清样品为CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为4.8%和6.9%,表明该检测方法具有较高的稳定性;特异性试验结果表明,间接ELISA方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清均无交叉反应;应用该间接ELISA方法随机检测80份猪血清样品,与进口阻断ELISA试剂盒相比其阳性符合率为83.58%,阴性符合率为76.92%,总体符合率为80.25%。结果表明本试验建立的间接ELISA方法具有很好的临床应用价值。     

牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原，建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件：抗原包被浓度为1μg／mL，酶标二抗稀释度为1：1600，血清稀释度为1：60，抗原和血清、血清和二抗均在37C反应30min，底物在37℃显色15min，D655nm阴性、阳性临界值为0．5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验，表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测，结果显示，阳性血清的符合率为27．8％，阴性血清的符合率为91．7％。     

山羊痘病毒G9蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

山羊痘病毒(GTPV)G9是一种膜蛋白,是潜在的优势抗原,为建立检测山羊痘的间接ELISA方法,本研究克隆GTPV G9基因并原核表达了重组G9蛋白,利用该蛋白作为包被抗原,经各反应条件优化建立了检测GTPV抗体的间接ELISA方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估。结果显示,原核表达的重组G9蛋白约为39 ku,且可以与GTPV阳性山羊血清发生特异性反应。间接ELISA方法经优化后的最佳条件为:重组G9蛋白的最佳包被浓度为1μg/mL,待检血清的最佳稀释度为1.80,鼠抗羊HRP-IgG的最佳稀释度为1.10 000。特异性结果显示,除GTPV阳性山羊血清检测结果为阳性外,副结核分支杆菌、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、布鲁氏菌的阳性山羊血清的检测结果均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,GTPV阳性山羊血清1.320稀释后检测结果仍为阳性,敏感性较高;批内、批间重复试验结果显示,变异系数均小于10%,重复性较好。利用本实验建立的间接ELISA方法检测45份临床山羊血清样品的结果显示,阳性血清8份,阴性血清37份,阳性率为17.8%;商品化ELISA试剂盒的检测结果显示,阳性血清9份,阴性血清36份,阳性率为20%。二者的符合率为97.8%。本研究为GTPV抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

间接ELISA检测犬细小病毒病血清抗体方法的建立

用犬肾细胞增殖犬细小病毒,经纯化﹑标化作为包被抗原,建立检测犬细小病毒抗体的间接ELISA方法。结果表明:抗原最佳包被浓度5μg/mL;血清最佳稀释度1:40,反应时间45min;酶标抗体最佳稀释度1:2000,反应时间45min;S/P≥0.240判为阳性,≤0.190判为阴性,介于二者之间为可疑。该抗原不与犬瘟热﹑犬传染性肝炎﹑犬冠状病毒病﹑猫泛白细胞减少症病原阳性血清反应;批内重复试验变异系数小于10%,批间重复试验变异系数小于15%;对20份免疫犬血清进行检测,阳性检出率为85%,明显高于血凝抑制试验(65%),符合率为80%。试验结果表明建立的间接ELISA检测犬细小病毒抗体方法特异、灵敏、可重复性好。     

鹅圆环病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立鹅圆环病毒(GoCV)抗体的检测方法,本研究通过原核表达重组核衣壳(Cap)蛋白,将纯化的该重组蛋白作为ELISA检测的包被抗原,利用交叉反应性,以羊抗鸡IgG(HRP-IgG)作为二抗,经反应条件的优化,建立了检测鹅血清GoCV抗体的间接ELISA方法。确立的ELISA反应最适条件为:抗原包被浓度为2.05μg/mL,待检血清稀释度为1∶50,HRP-IgG稀释度为1∶2000,待测血清和二抗均于37℃反应1.5h,底物于室温显色10 min。经38份阴性血清检测确定阴阳性临界值为0.25。特异性试验结果显示,该方法与大肠杆菌、新城疫、禽流感H5和H9、小鹅瘟、鹅副粘病毒抗原阳性血清均无交叉反应;重复性试验结果显示,其批内和批间变异系数均小于10%。应用该方法检测了从4群GoCV PCR检测阳性种鹅群采集的血清,结果显示其血清阳性率在60.0%～90.9%。本实验建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性,为进一步开展GoCV流行病学调查提供了一种便捷可靠的手段。     

鸽Ⅰ型副粘病毒F基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

将鸽Ⅰ型副粘病毒F基因亚克隆到p GEX-4T-1载体中,并用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌诱导表达。以纯化的F蛋白为诊断抗原,建立鸽Ⅰ型副粘病毒间接ELISA检测方法,用方阵法确定了间接ELISA检测的最佳条件:抗原1∶128稀释即抗原包被量为0.6μg/孔,血清1∶400稀释,与一抗的最佳作用时间为60 min,与酶标二抗的最佳作用时间为60 min,底物显色的最佳作用时间为15 min。用该方法对实验室保存的35份阳性血清和12份阴性血清进行检测,结果阳性符合率达到97%以上,阴性符号率达100%。     

A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因原核表达及间接ELISA方法的建立及应用

原核表达A型副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum serotype A,Hpgserotype A)的血凝素蛋白HA,并以HA蛋白为包被抗原,建立血清间接ELISA检测方法。克隆Hpg HA基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组HA蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Western blot鉴定;用纯化后的HA蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏度和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达获得大小约为37ku的重组HA蛋白;Western blot结果表明重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。Hpg间接ELISA优化反应条件为:抗原包被量每孔500ng,血清以1∶200倍稀释作用1h,酶标二抗以1∶2 500倍稀释作用1h,TMB显色时间为10min。在该优化条件下,OD_(450)≥0.34为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明对鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对85份阳性血清进行检测,敏感性为98.8%;重复性试验结果表明,批内和批间OD_(450)值的变异系数分别1.5%~3.7%和6.5%~8%。用本试验建立的方法对临床上215份鸡血清样品进行检测,阳性率为25.1%。说明建立的ELISA检测方法可用于Hpgserotype A抗体水平的检测。     

布鲁菌Rev.1株eryA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

通过对布鲁菌优势抗原eryA基因进行原核表达,在获得目的蛋白的基础上建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。构建原核表达载体pET-30a-eryA,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,镍柱亲和纯化eryA重组蛋白,SDS-PAGE 鉴定纯化蛋白,Western-Blotting检测反应原性后建立间接ELISA方法。反应条件优化后,抗原包被浓度为0.312 5 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液为5%猪源明胶,37 ℃作用2 h;血清稀释度为1∶100,37 ℃作用1 h;酶标抗体稀释度为1∶8 000,37 ℃作用45 min。血清稀释度为1∶1 600时,仍然检测为阳性,证明建立的间接ELISA方法灵敏性良好;其他菌种及病毒经过特异性检测,均为阴性,证明建立的间接ELISA方法特异性良好;通过重复性检测,批间及批内变异系数均小于10%,证明建立的间接ELISA方法重复性良好。检测临床血清样品,建立的方法与试管凝集试验总符合率为95.7%,证明该方法可初步应用于临床诊断。     

副猪嗜血杆菌AfuA-ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种特异性强、灵敏度高的副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）ELISA抗体检测方法,为副猪嗜血杆菌病的诊断及免疫抗体检测提供技术支撑,首先重组表达了HPS 2个具有免疫原性的蛋白（HbpA、AfuA）,随后对HbpA、AfuA进行初筛,选择AfuA作为最佳包被蛋白。通过优化AfuA-ELISA反应条件,确定了最佳抗原包被质量浓度为5μg/mL,最佳封闭液为5%脱脂乳溶液,最佳样品稀释液为2%BSA溶液,最佳样品孵育时间为30 min,最佳样品稀释度为1:25,最佳酶标二抗稀释度为1:20 000,最佳酶标二抗孵育时间为30 min,最佳底物孵育时间为10 min。特异性试验显示,建立的AfuA-ELISA方法对猪其他常见病原阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良较好的特异性。对300份临床样品进行检测,AfuA-ELISA方法分别检出阳性、阴性血清177、123份,与商业化试剂盒的阳性、阴性符合率分别为90.0%、87.5%,总体符合率为89.0%。结果表明,本研究建立的AfuA-ELISA方法具有特异性强、灵敏度高,与商业化试剂盒符合率高的优点,可...     

欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究利用原核表达并纯化的重组蛋白pCold TF-HA1作为包被抗原,建立欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA检测方法。通过反应条件的优化,确定了间接ELISA最佳工作条件:抗原最佳包被浓度为800 ng/孔,血清稀释度为1:200,封闭时间为1 h,一抗血清最佳作用时间为2 h,酶标二抗最佳稀释度为1:40 000,二抗最佳作用时间为1 h,TMB显色时间为7 min。阴/阳性血清的判断结果分别为OD_(450)≤0.255和OD_(450)≥0.292,介于两者之间为可疑。符合性试验结果显示,建立的间接ELISA方法与血凝抑制(haemagglutination inhibition,HI)检测的阳性率分别为53.27%和49.53%,两者总复合率达96.27%。特异性试验结果显示,该方法与古典H1N1亚型和H3N2亚型猪流感阳性血清无交叉反应。通过重复性试验表明,同一批制备的重组蛋白包被96孔酶标板,检测OD_(450)值的批内变异系数为1.97%~7.85%,批间变异系数为1.94%~6.93%。总之,本研究建立的禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA方法,具有敏感性较高、特异性强、重复性好的特点,为猪流感抗体检测提供了一种准确、快捷、简便、有效的技术手段,可用于禽源H1N1亚型猪流感抗体检测和流行病学调查。     

猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法的建立

为了建立一种快速定量检测猪伪狂犬病病毒（PRV）gB蛋白抗体的竞争化学发光酶联免疫检测方法,以大肠杆菌表达并纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记的抗gB蛋白单克隆抗体作为酶标抗体,以国家参考品稀释制备的校准品绘制标准曲线实现定量检测,成功建立的PRV-gB-CLEIA在45 min内即可完成检测,可检测到最大稀释倍数为1：2 048稀释的国家参考品;与猪瘟等其他5种病毒抗原的标准阳性血清无交叉反应;批内变异系数为1.13%~9.47%,批间变异系数为2.43%~14.07%,重复性和稳定性较好。通过对采集的180份临床血清检测结果进行比较,该方法与中和试验阳性符合率为94.00%,阴性符合率为96.92%,总符合率为96.11%,明显优于商品化ELISA试剂盒。本研究建立的PRV-gB-CLEIA检测方法可以用于PRV gB抗体的快速定量检测。     

伪结核棒状杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立伪结核棒状杆菌(Cp)血清抗体间接ELISA检测方法,以热灭活处理的不同的浓度Cp菌株作为固相抗原包被酶标板,用不同封闭液封闭,设置不同的封闭时间,再用不同稀释度的待检血清和不同稀释度的酶标二抗与之反应,以此优化间接ELISA反应条件,确定阳性临界值。对间接ELISA方法的特异性和重复性进行试验,并在此基础上对采集的临床样本进行检测。结果显示,最佳抗原包被量为OD600 nm=0.084的菌悬液100μL,10 g/L BSA封闭时间2 h,一抗血清稀释度为1∶400,酶标二抗的稀释度为1∶5 000,血清阴阳性的OD450 nm值临界值为0.352。该方法仅对Cp阳性血清呈特异性反应,与6种常见病原阳性血清均无交叉反应,特异性较强。批内试验和批间试验的变异系数均小于9.5%,重复性较好。敏感性试验结果表明,当伪结核标准阳性血清进行1∶1 280稀释时检测仍为阳性,敏感性较强。用该方法对10份经细菌分离鉴定为阳性的血清进行Cp抗体检测,结果均为阳性。用建立的方法对临床随机采集的423份血清进行检测,结果显示阳性率为35%。研究建立的抗体间接ELISA方法为Cp抗体检测及血清学调查奠定了基础。     

鸡传染性贫血重组抗原间接ELISA诊断方法的建立

本研究应用重组抗原,成功建立了检测鸡传染性贫血病毒血清抗体的间接ELISA诊断方法.确定了抗原最适包被浓度为5μg/mL,血清最适稀释度为1:100,其作用时间为60min,酶标抗体最适作用时间为60min,S/P≥0.24为阳性,≤0.19为阴性,介于二者之间为可疑的判定标准.该抗原不与鸡其他疾病的10种阳性血清反应,具有良好的特异性;批内重复试验,变异系数小于10%,批间重复试验,变异系数小于15%,具有良很好的重复性;该方法可检出人工接毒后20d的血清抗体,直到试验结束110 d时,仍能检出鸡血清阳性率为81%与全病毒包被抗原ELISA方法的检测结果符合率达92%以上,与进口诊断试剂盒的符合率为97%.本研究为现地免疫鸡群抗体检测和进行CIA流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.     

基于溶菌酶释放蛋白的猪链球菌间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立猪链球菌病的快速诊断方法,本研究以纯化的原核表达的猪链球菌溶菌酶释放蛋白(MRP)为包被抗原,通过各反应条件的优化建立了检测猪链球菌(SS)血清抗体的间接ELISA方法。实验确定了最佳抗原包被浓度为0.05μg/mL、待检血清最佳稀释倍数为1:400、最佳封闭液为5%脱脂乳、兔抗猪HRP-IgG的最佳稀释倍数为1:15 000、抗体阴阳性临界值为0.226。特异性试验结果显示,利用本研究建立的ELISA方法检测100份背景清晰的阴性血清,检出其中97份阴性血清,3份阳性血清,特异性为97%。利用该ELISA方法检测副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴氏杆菌、大肠杆菌、猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清,结果显示均为阴性,而猪链球菌2型(SS2)、SS7、SS9以及SS12阳性血清的检测结果均为阳性,表明该方法具有较强的特异性。敏感性试验结果显示,利用本研究建立的ELISA方法检测50份背景明确的阳性血清,检出其中48份阳性血清,2份阴性血清,敏感性为96%。当SS2阳性血清稀释倍数达1:3 200时仍为阳性结果,表明该方法具有较高的敏感。重复性试验结果显示,该ELISA方法批内、批间最大变异系数分别为4.70%和7.20%,表明该方法的重复性较好。对100份临床猪血清样品检测结果显示,本研究建立的ELISA方法与玻片凝集试验的符合率为85.3%,符合率较高。对440份来自东北三省部分地区猪场的血清样品检测结果显示,SS抗体阳性率为27.7%(122/440)。表明,东北三省部分地区猪场SS的感染率较高。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法可以用于SS2、SS7、SS9以及SS12血清抗体的检测,为SS病的血清流行病学调查提供了可靠的技术手段。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

采用RT-PCR方法扩增猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠埃希菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白得到成功表达。利用纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。ELISA抗原最适包被浓度为0.5μg/mL(0.05μg/孔),最佳封闭液为5g/L BSA,待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000,最适作用时间为45min,室温显色10min。用该方法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别<5%和<8%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用△E2-ELISA对350份血清样品进行检测,阳性率为77.71%,高于IDEXX试剂盒检测阳性率(67.14%),与IDEXX试剂盒阳性符合率91.06%,阴性符合率50%,总符合率77.43%。表明本试验建立的间接ELISA方法适于临床CSFV血清抗体的检测。     

鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立和应用

为建立特异性和敏感性较高的鸭坦布苏病毒(DTMUV)抗体检测方法,采用原核表达系统对DTMUV E蛋白的DⅢ结构域进行了双串联融合表达,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白大小约25 Ku。Western blot结果显示,经亲和层析纯化的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组DⅢ蛋白作为包被抗原,初步建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法。采用梯度稀释法对ELISA各种反应条件进行优化,确定最适工作条件。重组抗原最适包被浓度为5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,兔抗鸭酶标抗体最适稀释度为1∶1000;抗体临界值S/P≥0.336判定为阳性,S/P≤0.287判定为阴性,介于两者之间为可疑。该方法检测禽流感病毒、鸭源新城疫、鸭甲肝病毒、鸭圆环病毒、鸭细小病毒、经典呼肠孤病毒及新型鸭呼肠孤病毒等血清均为阴性,4个批次批内与批间重复试验的OD值变异系数分别为6.21%~7.27%和3.4%~7.2%,显示该法具有很好的特异性、稳定性和重复性。用建立的间接ELISA与中和试验分别对108份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,两种方法的阳性符合率为83.3%。     

鹅细小病毒NS2蛋白间接ELISA方法的建立

为建立检测鹅细小病毒(GPV)的间接ELISA方法,本研究表达了GPV重组NS2蛋白,并以Ni-NTA亲和层析柱纯化的蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA检测方法,并进行抗体消长规律的检测。用该方法检测阴性血清样本30份,确定检测临界值为0.281。与琼脂扩散试验结果的阳性符合率为100%,阴性符合率为86.67%。与抗鹅H5、H7、H9亚型禽流感病毒阳性血清和抗鹅副粘病毒阳性血清无交叉反应。在此基础上组装检测试剂盒,试剂盒批内变异系数为4.2%,批间变异系数为8.3%,包被抗原的酶标板在4℃可保存6个月。该方法对人工感染GPV血清检测结果表明,接种病毒后第8周,NS2蛋白的抗体水平达到峰值。本研究为GPV流行病学调查提供了一种快速、方便、敏感的抗体检测方法。     

鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体的间接ELISA检测方法,应用原核表达的IBDV VP2蛋白作为包被抗原,经方阵试验确定间接ELISA试验的最佳反应条件：包被抗原的浓度为8 μg/mL,标准阴、阳性血清的稀释度为1:400,封闭液选用10 %马血清,酶标抗体最佳稀释倍数为1:15000,最佳抗原稀释液为0.01 M PBS(PH 7.2);抗原最佳包被条件为4 ℃过夜,待检血清和酶标二抗反应条件为37 ℃ 60 min,底物作用时间为15 min。待检血清的OD450nm≥0.288判为阳性,反之判为阴性。特异性试验、敏感性试验和重复性试验结果显示,该方法的特异性好、敏感高、重复性好。用建立的间接ELISA方法与商品化IDEXX-ELISA试剂盒对临床血清样品进行检测,符合率为93.5 %。该方法的建立为检测IBDV抗体提供了一种安全、特异、敏感、方便经济的检测方法,为鸡传染性法氏囊病免疫监测和预防控制提供了科学的技术手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV N蛋白,亲和层析纯化后作为包被抗原,通过对各反应条件优化选择,建立了PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法,并进行了交叉反应和重复性试验,以及同类成品试剂盒间的应用效果对比试验。最终确定了抗原包被最佳浓度为2 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,血清及酶标二抗孵育时间均为30 min,显色时间为10 min,检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒等5种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该ELISA检测方法批内和批间重复性的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒效果比较显示符合率为94.7%。本研究建立的间接ELISA方法将为猪群感染野毒PRRSV后的快速诊断及流行病学调查提供一种简便易行、快速高效的血清学抗体检测方法。     

猪伪狂犬病病毒间接ELISA检测方法的建立

以纯化的PRV抗原为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了可检测PRV血清抗体的间接ELISA诊断方法。标定抗原的最佳包被量为0.802μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为60min,判定标准为OD 450nm值大于0.357为阳性,小于0.296为阴性,在0.296与0.357之间为可疑。该方法检测其他6种常见猪病病毒(CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、JEV、TGEV)的阳性血清均为阴性;与商品化ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为90.0%、87.1%、92.3%。本研究建立的PRV间接ELISA抗体检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV免疫猪群抗体监测、快速诊断和PR流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。