猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法的建立

为了建立一种快速定量检测猪伪狂犬病病毒(PRV)gB蛋白抗体的竞争化学发光酶联免疫检测方法,以大肠杆菌表达并纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记的抗gB蛋白单克隆抗体作为酶标抗体,以国家参考品稀释制备的校准品绘制标准曲线实现定量检测,成功建立的PRV-gB-CLEIA在45 min内即可完成检测,可检测到最大稀释倍数为1∶2 048稀释的国家参考品;与猪瘟等其他5种病毒抗原的标准阳性血清无交叉反应;批内变异系数为1.13%～9.47%,批间变异系数为2.43%～14.07%,重复性和稳定性较好。通过对采集的180份临床血清检测结果进行比较,该方法与中和试验阳性符合率为94.00%,阴性符合率为96.92%,总符合率为96.11%,明显优于商品化ELISA试剂盒。本研究建立的PRV-gB-CLEIA检测方法可以用于PRV gB抗体的快速定量检测。     

猪伪狂犬病gB抗体快速检测试纸条的研制和评价

为了建立一种猪伪狂犬病gB抗体检测试纸,为养猪业基层工作人员提供一种快速简便的狂犬病免疫抗体评价方法。胶体金标记gB蛋白作为探针,SPA和猪抗伪狂犬病病毒多抗IgG分别作为检测线和质控线,建立了猪伪狂犬病gB抗体检测试纸。猪伪狂犬病质控血清和疫苗免疫猪血清用来评价其特异性,敏感性以及与IDEXX PRV gB ELISA试剂盒的符合率试验。试验结果显示,该试纸条具有较高的特异性和敏感性,与IDEXX PRV gB ELISA试剂盒的符合率为91.04%;该免疫层析试纸条具有快速(5min)、特异、敏感等优点,不需要专门的仪器设备和专业技术人员,适合于田间推广应用。     

猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法的建立

用纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白为抗原,建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的gB-ELISA方法。最佳反应条件为：抗原包被浓度为3.15μg/mL,待检血清稀释度为1∶40。该方法对猪圆环病毒病、猪瘟、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征（猪蓝耳病）、猪乙型脑炎、猪布氏杆菌病5种疾病阳性血清和SPF猪阴性血清检测呈阴性反应。批间、批内试验变异系数均不超过8%。用该方法与HerdChek ELISA试剂盒同时对119份血清进行了平行检测,其相对敏感性、特异性和符合率分别为：75%、80.7%和79%。试验结果表明：猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性,且重复性好,可用于猪伪狂犬病毒血清抗体检测。     

猪伪狂犬病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种快速检测猪伪狂犬病病毒(PRV)的血清学方法,本实验采用原核重组表达的g E蛋白作为包被抗原,并对各反应条件进行优化,建立了检测PRV血清抗体的间接ELISA方法。以该方法检测PRV阳性血清和其它猪病病原阳性血清,除了PRV阳性血清呈阳性外,对其它猪病病原阳性血清的检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别是5.95%和9.62%。此外,使用该方法对250份临床血清进行检测,与国内外4种商品化试剂盒的检测结果比较符合率最高为83.6%。表明该方法可以用于PRV的临床检测,为PRV流行病学调查和防控提供了一种快速有效的检测方法。     

某规模种猪场猪伪狂犬病的净化与防控

为了检查出北京市郊区某规模种猪场隐性伪狂犬病感染猪并加以淘汰,达到净化猪场的目的,应用伪狂犬病病毒(PRV)gE蛋白抗体ELISA检测试剂盒对不同阶段猪群血清进行抽检。结果表明:该种猪场不同阶段猪均存在PRV gE抗体阳性猪,采取普检种猪并淘汰PRV gE抗体阳性猪、调整免疫程序、抓好综合性防控措施、采用PRV gB蛋白抗体ELISA检测试剂盒检测免疫抗体等方法,使该种猪场猪的伪狂犬病得到了净化。说明用PRV gE蛋白抗体ELISA检测试剂盒对血清样本进行检测,发现并淘汰PRV gE抗体阳性猪、调整免疫程序可以净化猪伪狂犬病。     

间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体

用猪肾传代细胞IBRS－2增殖猪伪狂犬病病毒（PRV）鄂A株，病毒培养上清液经硫酸铵沉淀、聚乙二醇（Mr20000）浓缩后作为包被抗原。用纯化的猪血清IgG免疫家兔，HRP村记撮的兔抗猪IgG，制备出高效价的酶标抗体，酶标抗体工作浓度为1：50000；经各种条件的选择，建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的间接ELISA。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为39.2mg/L，血清最佳稀释度为1：20，与猪细小病毒、猪、O型口蹄疫、猪衣原体标准阳性血清呈阴性反应，与标准阴性血清和临床未感染PRV的猪血清呈阴性反应；与猪伪狂犬病标准阳性血清、免疫猪血清和临床发病猪血清呈明显的阳性反应；与美国进口的PRV抗体检测ELISA诊断试剂盒检测结果比较，45份猪血清的阴、阳性检出符合率均为100％。表明建立的间接ELISA具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点，可用于猪伪狂犬病血清抗体的定性和定量检测。     

猪伪狂犬病病毒野毒LNA探针real-time PCR检测方法的建立

本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计特异性引物和LNA-TaqMan探针,建立了基于LNA-TaqMan探针的猪伪狂犬病病毒野毒株荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的方法能够特异性的检测出猪伪狂犬病病毒野毒株;灵敏度更高,最低检测下限为10个拷贝/μL;批内变异系数和批间变异系数分别为0.43%~0.64%、0.44%~2.34%,重复性良好。对67份临床样品进行检测,病毒分离培养法检测出23份阳性样品,LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法检测出26份阳性样品,常规TaqMan探针法检测出21份阳性样品,与病毒分离法比较,LNA-TaqMan探针法的符合率为96%。本研究建立的基于LNA-TaqMan探针检测猪伪狂犬病病毒野毒株的荧光定量PCR方法,为猪伪狂犬病的诊断和流行病学调查提供了可靠的技术支持。     

科技前沿

猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法的建立用纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白为抗原,建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的gB-ELISA方法。最佳反应条件为:抗原包被浓度为3.15微克/毫升,侍检血清稀释度为l:40。该方法对猪圆环病毒病、猪瘟、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征(猪蓝耳病)、猪乙型脑炎、猪布氏杆菌病5种疾病阳性血清和SPF猪阴性     

猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

为了满足我国现阶段猪伪狂犬病病毒(PRV)高频突变引发新疫情诊断的需求,本实验通过生物信息学分析比较,设计合成了针对PRV g B糖蛋白高度保守的抗原优势表位区肽段,命名为g B872。以此肽段为包被抗原,经条件优化建立了新型的PRV-g B间接ELISA抗体检测方法。该ELISA方法检测结果显示,其仅对PRV血清检测为阳性,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒(O型)、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,表明该方法具有较强的特异性;最低检测下限血清稀释度为1∶128,高于IDEXX PRV/ADV g B抗体检测试剂盒检测下限稀释度(1∶4),表明该方法敏感性高;批内、批间重复性试验结果显示,变异系数均低于10%,重复性良好。利用该方法与Bio Chek PRV-g B抗体检测试剂盒检测90份临床血清样品,对比结果分析显示,两者阳性符合率为100%,阴性符合率为97.67%,总体符合率为97.78%;同时,采用该方法与IDEXX-g I(gE)和IDEXX-g B试剂盒分别对野毒感染血清和疫苗免疫血清同时检测,该方法可以准确识别野毒阳性血清和疫苗免疫阳性血清,与IDEXX两种试剂盒的结果一致。本研究建立的间接ELISA检测方法对PRV疫苗免疫效果评价、流行病学调查及防控提供了可靠的方法。     

猪伪狂犬病血清抗体gE-ELISA检测方法的建立

以纯化的猪伪狂犬病病毒gE蛋白为抗原建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的间接gE-ELISA方法。最佳反应条件为，抗原包被浓度为1．7μg／mL，待检测血清1：40稀释。与伪狂犬病阳性血清反应为阳性，与猪瘟、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征（猪蓝耳病）、猪乙型脑炎、猪布氏杆菌病5种疾病阳性血清和猪伪狂犬病gE缺失疫苗接种的猪免疫血清及SPF猪阴性血清均无交叉反应。批间、批内试验变异系数分别不超过5％和9％。用该方法与Ingezim ELISA试剂盒和HerdChek ELISA试剂盒同时对172份血清进行了平行检测，总符合率分别达93．6％和83．7％。试验结果表明：猪伪狂犬病血清抗体间接gE-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性，且重复性好，可用于猪伪狂犬病野毒感染猪的血清抗体检测。     

伪狂犬病病毒变异株gC抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立变异伪狂犬病病毒FJ-2012株gC蛋白抗体间接ELISA检测方法,掌握不同猪场猪群的gC抗体水平情况。将FJ-2012株gC基因连接至pCzn1载体,转染至Arctic express(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blot验证,通过矩阵法试验、临界值的确定、特异性试验、重复性和敏感性试验,建立PRV-gC抗体间接ELISA检测方法,并对源于不同猪场的280份血清进行PRV-gC抗体检测。结果表明,成功表达获得FJ-2012株pCzn1-gC重组蛋白;建立的间接ELISA方法的最佳抗原包被浓度为10 μg·mL^-1和最佳样品血清稀释比例为1∶50,阴性和阳性判定的OD_{650 nm}临界值为0.406~0.438,介于之间的判定为可疑;临床检测结果显示,120份盲样猪血清PRV-gC抗体阳性率为91.67%、PRV-gB抗体阳性率为95.00%,两种抗体检测结果的整体符合率为95.83%;PR不稳定的猪场血样PRV-gC抗体阳性率为96.25%(77/80),而PRV已净化的种猪场血样PRV-gC抗体阳性率为78.75%(63/80)。因此,建立的PRV变异株gC抗体间接ELISA检测方法为临床猪血清抗体检测提供了特异、灵敏和稳定的技术,也为开展变异PRV血清学调查奠定基础。     

Expression and Immunogenicity Analysis of Porcine Pseudorabies Virus gB Protein

In order to study the expression and immunogenicity of porcine pseudorabies virus (PRV) gB protein,the specific primers were designed with the template of PRV preserved in the laboratory, and the 612 bp conserved gene fragments were amplified and sequenced, then it was cloned into the expression vector pET-28a and transformed into E.coli BL21 (DE3), the target protein was obtained after induced expression and purification.Western blotting was performed to analyse its immunogenicity. The results showed that gB protein was 30 ku, which mainly expressed in the form of inclusion body, and the concentration of the protein was 106 μg/mL, with well reactogenicity. 13 PRV positive serum and 16 negative serum in the samples were detected using ELISA Kit on sale, using positive serum, the PRV antibody detection method was initially established with the PRV gB protein as antigen package.     

猪伪狂犬病病毒gB蛋白表达及免疫原性分析

本试验旨在研究猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV） gB蛋白的表达并分析其免疫原性,以PRV病毒液为模板,设计特异性引物,扩增大小为612 bp的保守片段并测序,将其克隆到表达载体pET-28a中,转化表达菌BL21（DE3）,经诱导表达、纯化得到目的蛋白,进行Western blotting分析验证并分析免疫原性。结果表明,表达的gB蛋白大小为30 ku,主要以包涵体形式存在,复性后浓度为106 μg/mL,且具有良好的反应原性。应用市售试剂盒检测到样品中含13份PRV阳性血清和16份阴性血清,利用检出的阳性血清,初步可建立以PRV gB蛋白为包被抗原的PRV抗体ELISA检测方法。     

猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

以大肠杆菌原核表达系统表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白为抗原,建立猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法,优化ELISA反应条件,研制猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒。与商品化试剂盒相比,该检测试剂盒敏感性、特异性和符合率分别为95.12%、92.86%和94.55%;同时与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等多种病毒阳性血清无交叉反应。试剂盒具有较好的重复性,在-20 ℃至少可保存1年以上,将其应用于临床血清样品的检测,结果安徽、广东、广西采样猪场的PCV2阳性率分别为100%、48.39%、100%。     

检测猪伪狂犬病病毒gE抗体红细胞凝集试验的建立及应用

以纯化的抗人红细胞单链抗体(ScFv)—猪伪狂犬病病毒(PRV)gE蛋白双功能融合蛋白为抗原,建立了检测猪伪狂犬病毒gE抗体的红细胞凝集试验。利用方阵滴定试验筛选出最佳抗原工作浓度为55μg/mL,血清最佳稀释度为1∶20,作用时间15 min,与猪瘟(CSF)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪乙型脑炎(JE)、猪布氏杆菌病(Brucellosis)阳性血清和PRV gE缺失疫苗接种的猪免疫血清均不出现红细胞凝集现象,与PRV标准阳性血清反应出现肉眼可见的凝集圈。与美国进口的PRV抗体检测gE-ELISA诊断试剂盒检测结果比较,50份猪血清的阴、阳性检出符合率均为100%。红细胞凝集试验检测方法具有操作简便、敏感性和特异性较高的特点,可用于PRV野毒感染的快速筛查。     

猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gB主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

参照GenBank发表的猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gB主要抗原表位的编码区基因序列,设计一对引物,通过PCR扩增后,将约为600bp的目的片段克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-gB经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量约为42.4KDa,主要以包涵体形式存在。BandScan分析表明,表达量约占菌体蛋白的60.5%。利用His亲和层析方法得到了纯化的表达产物。Western blotting结果显示,重组蛋白能与阳性血清发生特异性反应,具有较好的抗原反应原性,可以作为检测用抗原。     

重组M蛋白-乳胶凝集试验检测PRRS病毒血清抗体的研究

利用纯化的 PRRS病毒重组 M蛋白致敏乳胶制成乳胶抗原 ,成功地建立了一种检测 PRRS病毒血清抗体的乳胶凝集试验 (L AT)诊断方法。用制备的乳胶 M抗原分别检测猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病、猪弓形体病、猪衣原体病、猪乙型脑炎阳性血清 ,结果均为阴性 ,无交叉反应 ,说明建立的 L AT方法具有良好的特异性。用建立的乳胶凝集试验方法与国外IDEXX公司 PRRS病毒抗体检测试剂盒同时对 76份猪血清样本进行检测 ,结果表明建立的 L AT方法的特异性和敏感性均为 95 % ,两种方法的总符合率为 87% ,检出率基本一致。研究结果表明 L AT方法具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点 ,是一种适合基层兽医单位用于 PRRS病毒血清抗体检测的新方法     

长沙市对伪狂犬病野毒感染的调查

为了解长沙市规模猪场伪狂犬病流行情况,对市内47个规模猪场送检的1534猪血清样品和22个已免疫伪狂犬基因缺失苗规模场送检的1300份血清样品,用ELISA方法对猪伪狂犬病野毒感染抗体（gpI抗体,下同）和免疫抗体（gB抗体,下同）进行检测。结果表明,长沙市规模猪场猪伪狂犬病gpI抗体阳性率为20.9%,场阳性率为44.7%;22个免疫猪伪狂犬基因缺失苗规模猪场猪伪狂犬病gpI抗体阳性率下降1.8%,场阳性数下降4.6%。结果表明,通过利用猪伪狂犬病基因缺失疫苗科学免疫,同时配合伪狂犬野毒抗体检测技术可以控制和净化规模猪场猪伪狂犬病流行。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准：当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。