鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及其F基因、HN基因的序列分析

利用RT-PCR技术,将从江苏省分离到的2株鸽源NDV的融合蛋白(F)和血凝素神经氨酸酶(HN)基因重要功能区片段进行扩增和序列分析,发现F蛋白多肽裂解位点的氨基酸序列为112K-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株序列特点.F基因分型及同源性比较显示,分离到的2株鸽源NDV PG-CH-JS-1-05,PG-CH-JS-1-06属基因Ⅵ型.与国内参考毒株YN-P1 F基因推导的氨基酸序列同源性最高为96.4%,与LaSota的同源性为84.1%～84.2%,与F48E9的同源性为86.0%～86.2%;与国外参考毒株Warwick66的同源性为92.7%～93.3%;HN基因氨基酸序列同源性比较显示,与PB9601的同源性最低,只有3.4%～3.7%,与LaSota的同源性也较低,为88.5 % ～88.7%.而与国外参考毒株IT-227-82的氨基酸序列同源性为95.4%～95.6%,与Pigen-NY-US-1984的同源性为94.8%～94.9%,与248 V B的同源性为92.5%～92.7%,说明与国外鸽源NDV分离毒株的遗传距离较近.     

从种蛋中分离的新城疫病毒抗原性及其F和HN基因的分析

对3株首次从种蛋中分离到的NDV进行交叉HI试验表明,这3株分离毒的交叉HI同源性为98.1%～100%。对这3株病毒及另1株从输卵管分离到的NDV的F与HN完整基因进行扩增并克隆测序,序列结果登陆GenBank(FJ011441～FJ011448)。氨基酸同源性分析表明:这4个毒株的F与HN基因同源性分别为99.5%～99.8%和99.6%～100%,远高于其与Lasota、F48E8株以及目前国内流行的其他基因Ⅶ型毒株的同源性。分离株F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特征,根据绘制的遗传进化树分析,属于基因Ⅶ型。研究结果显示这4个不同来源毒株其2个基因的同步高度同源性可能与它们均是与生殖道感染有关。     

两株鸽源新城疫病毒的分离鉴定及F基因序列分析

从四川省两个不同肉鸽养殖场的送检病鸽中分别分离出2株鸽源新城疫病毒(NDV),分别命名为Mianyang12505和sms12。致病性试验表明2株鸽源NDV均为弱毒,但融合蛋白(F)基因序列分析表明2个毒株均含有典型的强毒株F蛋白裂解位点112RRQKRF117;以F基因序列为基础构建遗传发育树,发现2株鸽源NDV属于基因Ⅵ型;F基因突变分析表明,鸽源NDVF基因突变率较大,且基因Ⅵ型和Ⅶ型存在规律突变;核酸和氨基酸序列同源性分析表明,国内鸽源NDV毒株核酸序列同源性为83.5%～99.7%,氨基酸同源性为85.6%～100%,且本研究分离的毒株与JS0722Pi同源性最高。     

新城疫病毒HeB02分离株F基因的序列分析

根据国外已发表的新城疫病毒F基因序列，设计了1对引物，并以RT-PCR特异性扩增出新城疫病毒HeB02分离株的F基因，基因产物大小为1．63kb，与设计相符。对其进行序列测定后，与其他标准毒株F48E9、LaSota和Clone30的F基因进行了同源性比较，结果表明，HeB02株与国内标准强毒株F48E9及目前广泛应用的弱毒疫苗株LaSota和Clone30的F基因核苷酸序列的同源性分别为88.1％、84.9％和83.8％。由此可以看出，HeB02分离株与标准毒株和疫苗株相比，在F基因上发生了变导。     

新城疫病毒广东分离株HN基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法从6个新城疫病毒(NDV)广东分离株中扩增HN基因cDNA片段。并将其克隆至pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。结果表明，6个NDV分离株HN基因片段长度均为1704bp，编码568个氨基酸；彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为96．0％～99．8％和98．6％～100％，与其他基因Ⅶ型毒株的氨基酸序列同源性为96．8％～98．4％；但与其他基因型毒株如D26、Ulster/67、B1、LaSota以及GB Texas的氨基酸同源性较低，为88．2％～91．0％。     

蛋鸡输卵管积液中新城疫强毒的分离鉴定与分子特征

从病鸡输卵管积液中分离了一株新城疫病毒(命名为SHY06),经蚀斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间和1日龄雏鸡脑内致病指数分别为52 h和2.0,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-RRQKRF-117,符合强毒NDV的特征.根据F基因(1-374 bp)对SHY06和19个NDV参考毒株进行基因分型结果表明SHY06属于基因Ⅶ型.F基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与基因Ⅶ型NDV分离株同源性为97.5%～99.5%,与基因Ⅸ型NDV(F48E9等)同源性为91.7%～92.4%,与基因Ⅱ型(疫苗株LaSota等)同源性为89.2%. HN基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与近年来分离株同源性较高,为92.1%～99.7%,与疫苗株(LaSota)和标准强毒株(F48E9)同源性较低,分别为87.6%和89.9%.     

不同动物来源的新城疫病毒F基因序列分析

为了解广西地区新城疫病毒（NDV）在不同动物宿主内的分布流行情况,对从广西地区鸡、野鸟、猪、鹅、马等5种不同动物体内分离到 NDV 毒株,进行了 F 基因的克隆扩增和序列分析。结果表明,5个NDV 分离株 F 基因的核苷酸序列同源性为85．2％～98．6％,推导氨基酸序列同源性为88．9％～98．6％,同源性差异较大;5个毒株的 F 基因与国内贵州、长春、福建等地的当前流行株同源性较高;以 F 基因前374 bp核甘酸同源性比较分型表明,鸡源、鹅源、马源毒株为当前流行的基因Ⅶ型,而猪源毒株和野鸟源毒株为传统的基因Ⅱ型。     

不同宿主源NDV毒株对SPF鸡致病性研究

为阐明不同宿主及不同基因型新城疫病毒（NDV）对SPF鸡致病性,选择分离自鸡、番鸭、鹅、健康野鸟的基因Ⅶd亚型NDV6株,鸡源基因III型和鸽源基因Ⅵb型毒株各1株．以及基因Ⅸ型强毒F48E9,共9株NDV毒株进行致病性试验。在对各毒株的EID50及主要致病指数MDT、ICPI测定基础之上,以相同剂量感染15日龄SPF鸡,观察临床症状及剖检病变,计算发病率和死亡率,并在攻毒后不同时间采集主要组织样品,以SYBR Green I Real-time PCR检测病毒最早出现时间及病毒载量。结果表明,6株基因Ⅶd亚型NDV毒株导致SPF鸡100％发病,死亡率90％以上,     

实时荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒RNA

根据新城疫病毒（NDV）核苷酸序列，设计针对中、强毒力NDVF基因编码融合蛋白裂解位点的核苷酸序列引物和TaqMan探针，建立了实时荧光定量反转录荧光定量PCR（RRT—PCR）检测中、强毒力NDVRNA的方法。该方法能从舍有NDVI系疫苗毒、NDV标准强毒株F48E9（基因Ⅸ型）、分离鸡源强毒株（基因Ⅶ型）和鸽源强毒株（基因VI型）样本中检出NDVRNA，不与NDV弱毒株（LaSota、Clone30、B1、V4）、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒及健康鸡组织RNA发生交叉反应，对NDV核酸的最小检出量为60个拷贝，具有检测速度快、特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等特点。从9个临床样本中均检测出阳性信号（9／9），PCR产物经测序证明均舍有NDV强毒株F基因裂解位点；用其中8份病料接种SPF鸡胚分离病毒，分离率为5／8。     

不同基因型新城疫病毒株对鹅的致病性

用不同基因型(Ⅳ、Ⅵb、Ⅵg、Ⅶd(坞源)、Ⅶd(鹅源)、Ⅷ、Ⅸ)新城疫病毒(NDV)强毒株分别人工感染23日龄隆昌鹅，观察了其对鹅的致病性。结果：各株病毒均可使接种鹅感染、发病，发病串为10％～100％，死亡率分别为0％、20％、30％、70％、50％、40％、50％。接种Ⅵg、ⅦdI、Ⅶ和Ⅸ型NDV强毒株可使鹅严重发病、死亡，症状和病变都与Ⅶd亚型鹅源毒株感染鹅相似，接种Ⅳ型(Herts／33)及Ⅵb亚型(PB9601)毒株的鹅轻微发病。免疫组化检检测发现，攻毒鹅多种组织器官中都能检测到病毒抗原。在能检测到病毒抗原的器官中，病毒抗原主要定位于淋巴细胞、网状细胞、巨噬细胞、肝细胞及各种上皮细胞的胞浆内；与Ⅵg、ⅦCl、Ⅶ和Ⅸ型NDV感染鹅组织相比，Herts／33、PB9601感染鹅大部分组织内的阳性染色较弱。本试验结果表明，不同基因型NDV强毒株对鹅的致病性存在明显差异。     

Validation and standardization of virus neutralizing test using indirect immunoperoxidase technique for the quantification of antibodies to rabies virus

A virus neutralizing test using an indirect immunoperoxidase technique (VNT-IIP) for rabies has been developed for the titration of dog and cat serum samples in Japan. The VNT-IIP has the advantage that results obtained can be viewed by the naked eye. The purpose of this study was to validate the VNT-IIP and compare it with one of the international standard methods, the fluorescent antibody virus neutralization test (FAVNT). The VNT-IIP showed satisfactory repeatability, high analytical specificity and good accuracy. Regarding the comparison between the VNT-IIP and the FAVNT, the VNT-IIP showed good agreement (91.9%), high sensitivity (92.8%) as well as specificity (87.0%) and good correlation (r = 0.92). As described above, the validation of the VNT-IIP was satisfactory and the performances of the test proved to be equivalent to those of an international standard method.     

重组伪狂犬病病毒(rPRV-GP5)对绵羊的安全和效力试验

为了验证表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重组伪狂犬病病毒(rPRV-GP5)的安全性和免疫原性,将10只5～6月龄健康绵羊分成三组,安检组(3只)肌注108.0PFU/只、效检组(4只)肌注106.0 PFU/只,3只作为不接种对照组.接种后14 d,效检组与对照组每只臀部肌注伪狂犬病病毒"双城系"猪源强毒S株103 LD50,结果效检组全部保护,对照组全部死亡,安检组未见异常.结果表明,重组病毒完全符合伪狂大病活疫苗制造及检验规程中对疫苗的安全和效力检验标准.     

马病毒性动脉炎血凝及血凝抑制试验研究与应用

在RK-13细胞上培的马动脉炎病毒在4℃、室温和37℃条件下，用各种动物的红细胞进行血凝试验，证实病毒在不同温度下均可凝集小鼠和鸡的红细胞，但不能凝集牛、绵羊、山羊、马、猪、豚鼠、仓鼠、兔及鹅红细胞，病毒用吐温-80和乙醚处理后，血凝活力会显著增强，其血凝滴度比未经处理的病毒高4-8倍，且血凝像更加清晰，最适处理条件是病毒在冰、浴状态下用终浓度0.06%-0.125%(V/V)二温-80振荡处理15min-60min，再加50%（V/V）乙醚振荡作用5min-15min。用EAV免疫SPF豚鼠，4周后采血做HI和NT试验，显示HI抗体和NT抗体产物成正相关，对550份来自新西兰、吉尔吉斯、内蒙古、新疆的马血清做EAV的抗体检测，比较两个试验，二者符合率为97.8%，血凝抑制抗体与中和抗体效价呈显著的正相关，但抗体效价略低于后者。     

赤羽病琼脂免疫扩散试验诊断方法的研究

应用引自美国和日本的羽病毒和标准阳性血甭,制备了琼脂免疫扩散试验（ＡＧＩＤ）抗原和高免阳性血清,建立了赤羽病ＡＧＩＤ诊断方法。应用此方法对上海、杭州、广州等地的１３８３头牛进行了检疫,ＡＧＩＤ抗体阳性牛７４６头,阳笥率５４．０％,与流行情况相符。同时对从澳大利亚、美国、新西兰和加拿大等国进口的牛、羊、猪血清１６２头份进行了检疫,全部为ＡＧＩＤ抗体阴性。     

琼脂扩散试验检测雏鹅新型病毒性肠炎病毒及抗体的研究

本文报道１种检测雏鹅新型病毒性肠炎病毒及抗体的琼脂扩散试验。以１／１５Ｍ ｐＨ７．２ＰＢＳ配制的含０．８５％琼脂糖凝胶检测效果最好,对ＮＧＶＥＶ提纯抗原和兔抗ＮＧＶＥＶ的ＩｇＧ的最低检出量分别为０．１５ｍｇ／ｍｌ和０．０５ｍｇ／ｍｌ。１次加样和２次加样对ＮＧＶＥＶ感染死亡雏鹅的肠、肝脏、心、脾、肾、胰腺的阳性检出率分别为１００％、８０％、４０％、５０％、２０％、６０％和１００％、１００％、５６％、     

三种检测猪伪狂犬病抗体的方法比较

应用血清中和试验(SNT)、乳胶凝集试验(LAT)和PRVgpI抗体鉴别ELISA三种方法检测了42份猪血清中的伪狂犬病抗体效价并进行了比较。结果表明SNT与LAT二种方法的阳性符合率为87.1%(27/31),阴性符合率为90.1%(10/11),总符合率为88.1%(37/42),且SNT的敏感性高于LAT,但PRVgpI抗体与SN和LA抗体无相关性。     

鸡减蛋综合征病毒的血清学关系研究

利用血凝抑制试验和病毒中和试验对ＥＤＳ地方分离毒ＨＳ－１和国际标准毒ＡＶ－１２７之间的血清学关系进行了研究。分离病毒的血凝特性能够被ＡＶ－１２７高免血清、ＨＳ－１高免血不表所抑制，而不能与ＮＤ阳性血汪民生交叉反应；在病毒中和试验中，ＨＳ－１毒株与国际标准毒株ＡＶ－１２７能够发生交叉中和反应，且两毒株的亲缘值为９５％。结果表明，两者为同一血清型。     

蓝舌病病毒甘肃分离株的定型研究

继利用蚀斑抑制中和试验对蓝舌病病毒山东分离株（L001）进行血清型鉴定后，又对蓝舌病病毒甘肃分离株进行了血清型鉴定，证实甘肃分离株为蓝舌病病毒11型。     

赤羽病微量病毒中和试验诊断方法的研究

应用引自日本的赤羽病病毒，制备了微量病毒中和试验抗原和高免阳性血清，建立了赤羽病微量病毒中和试验诊断方法，应用此方法对广东省７２４头牛血清进行了检查，阳性率为３５．３％，对上海６６５头牛血清作了检查，阳性率为６７．７％，说明这些地区曾流行过赤羽病，同时对澳大利亚当地牛１０８头进行检查，阳性率为５５．５％，与外报道一致。对澳大利亚、加拿大，美国进口牛１７３头的检查结果，全部阴性，对澳大利亚进口羊９９２头的检查结果，发现阳性１头，已得到澳方认可。     

应用荧光抗体检测马鼻肺炎病毒的实验研究

用自然感染马阳性血清及兔免疫血清制备的马鼻肺炎荧光抗体(EHV_1·FA),和马鼻肺炎病毒(HEV_1)不同毒株以及从匈牙利引进的Bartha株标准毒均产生特异性荧光。通过对不同滴度地鼠肾细胞培养液内抗原的测定,表明EHV_1·FA法比补结反应及细胞病变法敏感,高1～2个滴度,应用冰冻切片直接荧光染色检查乳地鼠31份,肝阳性率为83.8％,肺阳性率为77.4％,对照10份均为阴性。检查人工感染HEV_1流产胎儿5份,肝阳性率为100％,肺阳性为80％,检查2份健康驴胎儿,均为阴性。表明应用冰冻切片、直接荧光染色检查马鼻肺炎病毒具有较高特异性和检出率。