表达H3N2亚型猪流感病毒HA的重组伪狂犬病病毒对仔猪的免疫效力评价

利用猪流感病毒(Swineinfluenza virus,SIV)与伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)血清学阴性的4周龄断奶仔猪,对此前构建的表达SIVA/Swine/Inner Mogolian/547/2001(H3N2)血凝素(HA)基因的重组伪狂犬病病毒(rPRV-HA)进行了免疫效力评价。按每头105.0PFU rPRV-HA肌肉注射断奶仔猪(n=12),同时设Bartha-K61免疫对照组(n=5)和非免疫攻毒对照组(n=5)。免疫后35d用2×105.0TCID50的SIVA/Swine/Heilongjiang/74/2000(H3N2)进行强毒攻击。rPRV-HA免疫组免疫后7d均可检测到高滴度针对SIV的血凝抑制(HI)抗体,而所有对照组小猪仅在攻毒后7d才开始产生针对SIV的HI抗体;rPRV-HA免疫组在病理学保护方面明显优于对照组,支气管和肺泡冲洗液病毒分离结果显示,攻毒后7d rPRV-HA免疫组没有检测到病毒,而两个对照组可检测到病毒。以上试验结果表明,rPRV-HA免疫猪对同亚型SIV的攻击具有很好的保护作用。     

重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对高致病性PRRSV N蛋白基因表达的抑制作用

构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路.     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的安全性试验与最小免疫剂量测定

将表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-ILTVgB)通过鸡胚成纤维细胞培养,加入适当的保护剂制成冻干疫苗.取3批冻干疫苗,生理盐水稀释后分别经翅内侧无血管处皮下接种14日龄和50日龄SPF鸡,接种剂量为5 × 106PFU,接种后3天出现局部反应,5天局部肿胀达到最大,接种鸡无其它全身反应,精神、食欲以及发育等均不受影响,说明重组病毒对试验鸡是安全的.取其中的200003批疫苗,用生理盐水作210-2～210-5稀释后,翅内侧无血管处皮下接种40日龄SPF鸡,免疫后4周分别攻击传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒102株,结果表明,重组病毒对试验鸡翅内侧皮下接种能产生良好的免疫力,在接种剂量为210-2～210-40.1ml/鸡的范围内可以使全部试验鸡产生局部反应,当接种剂量为210-50.2ml/鸡时可以使部分试验鸡(5/15)产生局部反应,鸡体对重组疫苗的最小反应剂量为210-40.1ml(相当于1000PFU).攻毒试验结果进一步证明,当接种剂量为210-40.1ml(相当于1000 PFU)时可以使免疫鸡产生可靠免疫力,抵抗传染性喉气管炎病毒WG株强毒和鸡痘病毒102株的攻击,降低鸡群的发病率和病死率.这些结果说明,疫苗接种后的局部反应与重组疫苗的免疫效力之间具有相关性,疫苗对接种鸡的局部作用反应了疫苗的免疫效力,我们研制的重组疫苗的最小免疫剂量为1000 PFU,这就为我们进一步考察疫苗的免疫效力试验奠定了基础.     

表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的伪狂犬病病毒拯救与纯化

为研制预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗候选毒株，本研究依据HP-PRRSV HuN4毒株GP5基因序列设计并合成1对特异引物，BamHⅠ引入到引物的5′端，从HP-PRRSV毒株的RNA中，用RT-PCR扩增HP-PRRSV GP5基因。将BamHⅠ酶切的PCR产物与同样酶切并去磷酸化的PRV转移载体pG相连接，构建重组质粒pG-GP5/HP-EGFP。采用脂质体转染法将pG-GP5/HP-EGFP质粒转染已接种PRV三基因缺失毒株rPRV-gE^-/gI^-/TK^-的ST细胞中，经病毒空斑纯化，获得携有HP-PRRSV GP5基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的重组伪狂犬病病毒rPRV-GP5/HP-EGFP。将重组病毒rPRV-GP5/HP-EGFP接种CRISPR/Cas9 EGFP敲除质粒转染过的ST细胞，经4轮病毒空斑纯化，最终获得无绿色荧光蛋白的重组病毒rPRV-GP5/HP。经PCR鉴定及测序，证实获得的rPRV-GP5/HP在EGFP基...     

中药炎康注射液对伪狂犬病病毒的抑制试验

用鸡胚培养法和红血球凝集(HA)试验,测定中药炎康注射液对伪狂犬病病毒的抑制作用。试验共分4组:第Ⅰ组同时接种病毒尿囊液与中药炎康混合液,HA滴度为0。第Ⅱ组同时接种病毒尿囊液与西药金刚烷胺混合液,HA滴度为4 log2。第Ⅲ组同时接种病毒尿囊液与生理盐水混合液,HA滴度为7 log2。第Ⅳ组不接种病毒尿囊液,不给药,HA滴度为0。结果表明,中药炎康注射液对鸡胚无毒性作用;中药炎康与病毒同时接种鸡胚,能完全抑制伪狂犬病病毒在鸡胚中增殖。     

猪伪狂犬病基因缺失灭活疫苗(JS-2012-△gI/gE株)的制备及免疫效力评价

本研究将猪伪狂犬病毒双基因缺失毒株(JS-2012-△g I/g E株)用0.15%的甲醛灭活后,与赛彼科公司MONTANIDE ISA201VG佐剂进行乳化,制备成猪伪狂犬病灭活疫苗。为了评价灭活疫苗的免疫效力,15头14日龄的健康仔猪(猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪圆环病毒Ⅱ型抗原和抗体均为阴性)随机分成3组,每组5头。第一组猪颈部肌肉接种猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△g I/g E株)每头2 m L,接种后28 d,第一组和第二组同样方式同等剂量接种猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△g I/g E株),第三组猪作为对照。第二次免疫后d 28,三组实验猪均滴鼻接种PRV JS-2012第5代强毒,每头105.0TCID50/2 m L。攻毒后0~14 d,每日测量体温并记录临床症状。通过抗体检测和保护效率来评价猪伪狂犬病灭活疫苗(JS-2012-△g I/g E株)免疫效力。结果表明,两次免疫(第一组)PRV g B抗体水平明显高于一次免疫(第二组),两次免疫提供了更好的保护效力。     

重组伪狂犬病病毒疫苗的研究进展

随着分子生物学技术的发展及对伪狂犬病病毒(PRV)研究的不断深入, 伪狂犬病病毒载体的研究已成为病毒载体研究领域的热点之一.通过基因工程技术使伪狂犬病病毒的毒力基因失活构建表达外源基因的重组质粒,再通过同源重组获得毒力减弱但仍具有良好免疫原性的重组病毒,重组病毒疫苗在动物体内的表达不仅十分安全,而且还可以一针多防,提高生产效率.文章对以伪狂犬病病毒为载体研制重组疫苗的研究进展进行了综述.     

猪伪狂犬病病毒的分离和鉴定

从病猪脑部分离到1株病毒.该病毒接种Balb/c小鼠出现神经症状,病死率为60% ,接种PK-15细胞出现拉网病变.伪狂犬病阳性血清能特异性的中和该分离毒.根据基因库(GenBank)的PRV gE基因设计的引物能扩增出特异性片段,证实该病毒为伪狂犬病病毒.     

H7亚型禽流感病毒血凝素基因重组鸡痘病毒活载体疫苗免疫原性评估

本研究以细胞感染-转染技术构建了一株表达H7亚型禽流感病毒(AⅣ)血凝素(HA)基因的重组鸡痘病毒rFPV-HA.以5×105PFU的rFPV-HA经翅下刺种免疫8周龄SPF鸡,免疫后第3周用100 CID5o的HA基因同源AⅣ A/Arfi St/eng-Q/983/79(H7N1)进行人工感染,1周后采集泄殖腔棉拭子进行病毒分离.免疫后第三周及攻毒后第1、2周对所有动物进行静脉采血,检测血凝抑制(HI)抗体和免疫沉淀(AGP)抗体.结果,攻毒前部分rFPV-HA免疫鸡可检测到HI抗体,但检测不到AGP抗体,野生型病毒(F017)接种组和空白对照组HI抗体和AGP抗体均为阴性.攻毒后rFPV-HA免疫组的HI抗体上升速度明显高于野生型病毒接种组和空白对照组.rFPV-HA免疫组有6/8的鸡为流感病毒分离阴性,野生型病毒接种组和空白对照组的试验鸡病毒分离全部为阳性.结果表明rFPV-HA可诱导鸡产生有效的免疫保护反应,阻止或降低消化道病毒排泄.rFPV-HA的成功构建为研制开发H7亚型禽流感活载体疫苗奠定了良好的基础.     

表达传染性支气管炎S1基因和IFN-γ基因重组鸡痘病毒安全性与最适免疫剂量分析

对共表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因和II型干扰素基因的重组鸡痘病毒（rFPV-IFNγS1）冻干疫苗进行安全性和最适免疫剂量的研究。取冻干疫苗,加生理盐水恢复至冻干前体积,分别取0.1 mL经翅内侧无血管处皮下接种1周龄SPF鸡,接种剂量为1.0×10^5PFU,接种后3 d出现局部反应,5 d局部肿胀达到最大,接种鸡无其它全身反应,精神、食欲以及发育等均不受影响,说明重组病毒对实验鸡是安全的。将重组疫苗用生理盐水作倍比稀释后翅内侧无血管处皮下接种4周龄SPF鸡,接种剂量为1.0×10^1-1.0×10^4PFU,免疫后3周攻击传染性支气管炎病毒LX4株。结果表明,在接种剂量为1.0×10^2-1.0×10^4PFU的剂量范围内均可以使全部实验鸡产生局部反应,并对IBV的攻击形成保护,降低免疫鸡的发病率和死亡率,发病保护率达到73%以上;1.0×10^1PFU接种实验鸡后,仅有5/11的鸡出现局部反应,对IBV攻击的发病保护率为64%,与对照组差异不显著（P〉0.05）。以上结果说明,疫苗接种后的局部反应与重组疫苗的免疫效力之间具有相关性,根据疫苗生产使用实际情况确定传染性支气管炎重组鸡痘病毒疫苗的最适免疫剂量为10^3PFU。     

猪伪狂犬病调查

这几年 ,猪伪狂犬病在我国不少地区呈流行或暴发流行 ,主要引起母猪的繁殖障碍 ,新生仔猪大量发病并死亡 ,给养猪业造成重大的经济损失。现将广西某瘦肉型猪场发生猪伪狂犬病的情况报告如下。1　基本情况该猪场为一家新办的小型瘦肉型猪场 ,场址选择在山边 ,不设围墙 ,鼠患相当     

猪伪狂犬病的诊断

本文通过荧光抗体组织切片、细胞接种、兔子致病性等方法对临床怀疑为猪伪狂犬病的病猪进行了实验室诊断。结果如下:病猪脾脏和淋巴结制备的冰冻切片经PRV荧光抗体染色后,在荧光显微镜下见到特异性荧光;病料经处理后接种Vero细胞可致细胞圆缩和形成合胞体,具有疱疹病毒的培养特征;将病料上清和细胞培养毒分别皮下接种家兔均可引起奇痒、麻痹死亡,呈现典型的伪狂犬病临床特征,同时病死兔脏器的PRV免疫荧光试验也为阳性。根据上述结果证实了该病为猪伪狂犬病。     

实验室检测在规模化猪场伪狂犬病免疫程序调整中的应用

为了对福建宁德某规模化猪场伪狂犬病免疫程序进行调整,应用ELISA法对待配后备母猪、繁殖母猪(怀孕40d母猪、怀孕70d母猪和哺乳母猪)、公猪以及60日龄、90日龄、120日龄和160日龄商品猪血清同时进行猪伪狂犬病gE和gB抗体检测,以掌握不同阶段猪伪狂犬病野毒的感染情况并制定适合本场的猪伪狂犬病免疫程序。免疫程序调整以后的检测结果显示:通过对不同猪群伪狂犬病疫苗程序的调整,商品猪后期和待配后备母猪伪狂犬病野毒感染为阴性,说明目前场内采用实验室检测调整伪狂犬病免疫程序的方法是科学的。     

猪伪狂犬病的诊断与防治

猪伪狂犬病是一种急性传染病,为国家中长期动物疫病防治规划(2012～2020年)明确的优先防治的二类疫病之一,目前在许多国家已经对该病进行了净化,但在我国猪群中此病并没有消失。近年来,该病在我国部分省市的规模化猪场时有发生、流行,给养猪业造成了严重的经济损失,因此,加强对该病的诊断、防治及净化意义重大。     

猪伪狂犬病研究进展

伪狂犬病也称奥叶基氏病、奇痒症,是由甲型疱疹病毒引起的一种传染病。该病毒可感染人类和无尾猿以外的所有哺乳动物。文章主要对该病的病原学、流行病学、临床症状、免疫学特点、诊断、防治作了阐述,为研究该病提供理论参考。     

猪伪狂犬病血清学调查

为调查猪伪狂犬病目前在青海省的流行情况,笔者于1999-2002年应用酶联免疫吸附试验(ELISA)对来自8个县(市)的养猪场和农户散养生猪共计3611份血进行了猪伪狂犬病血清抗体检测,报告如下。1 材料1.1 诊断试剂 采用美国IDEXX公司的Pseu-     

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)对变异株的保护效力

本研究旨在检测仔猪免疫猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)后,抵抗伪狂犬病病毒(PRV)变异株攻击的保护效果。取4~6周龄PRV抗体阴性仔猪,接种猪伪狂犬病活疫苗,1周后用PRV变异株(AH02LA株)攻毒,检测攻毒后临床症状、直肠温度、鼻腔排毒和肺部病变。疫苗免疫组在免疫后7 d均可以检测到gB抗体。攻毒对照组攻毒后出现典型伪狂犬症状,发病率为100%,死亡率为60%,所有猪只鼻拭子均检出排毒,所有猪只肺部均有出血、淤血等病变。免疫组的猪只攻毒后,所有猪只均未出现明显临床症状,部分猪只鼻拭子检出排毒,排毒持续时间缩短,排毒量显著减少,所有免疫猪只肺部未见明显病变。结果表明:伪狂犬病活疫苗免疫猪后对PRV变异株的攻击具有良好的保护效果。     

猪伪狂犬病继发链球菌病的诊治

1999年 1 1月 ,我市某规模猪场陆续出现 30多头母猪流产 ,配种后返情多 ,屡配不孕 ,至 1 2月初又出现初生仔猪高死亡率的症状 ,一般都整窝死亡 ,分别存活 1～ 2头也生长不好 ,经过临床检查、病理剖检 ,并送浙江大学动物科学学院进行微生物学检验、生化试验、动物接种试验、血清学检验 ,经药物治疗、疫苗接种等工作 ,确诊为猪伪狂犬病继发链球菌病 ,这在我市尚属首次 ,报告如下。1　基本情况该场存栏公猪 7头 ,生产母猪 2 80头 ,哺乳仔猪870头 ,肉猪 1 2 0 0多头。从 1 999年 1 1月下旬 ,出现断奶前后的仔猪零星死亡 ,该场曾作猪瘟处理 ;继而…     

猪伪狂犬病的研究进展

猪伪狂犬病 (Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ,Ｐｒ)是由猪疱疹病毒Ｉ型 (ＰｏｒｃｉｎｅＨｅｒｐｅｒｖｉｒｕｓＴｙｐｅＩ)引起的一种以发热、脑脊髓炎为主症的急性传染病。本病主要引起母猪流产、产死胎或木乃伊胎 ;初生仔猪表现出神经症状 ,最后麻痹、衰竭而死亡 ,死亡率可达 1 0 0 % ;成年猪多耐过而呈隐性感染 ,是该病主要的传染源。猪Ｐｒ自 1 90 2年匈牙利奥耶斯基 (Ａｕ ｊｅｓｋｙ)首先发现以来 ,目前世界上已有 40 0多个国家发生此病 ,虽然许多国家都采取了不同措施进行防制 ,但疫情仍不断扩大蔓延。发达国家已将本病列为重点防制疫病…