鉴别牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒的复合PCR方法及其应用

以牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)特异引物 P1/ P3扩增 BVDV标准毒株及以猪瘟病毒 (HCV)特异引物 P2 / P3扩增HCV阳性病料 ,分别扩增出 32 6 bp和 2 5 2 bp的特异片段 ;以 P1、P2、P3扩增 BVDV和 HCV人工混合感染样品 ,扩增出大小为 32 6 bp和 2 5 2 bp的 2条片段 ,建立了特异的一步检测 BVDV和 HCV的复合 PCR方法。以建立的复合 PCR方法检测 BVDV分离株 ,都扩增出 1条 32 6 bp的特异片段 ;从吉林等地送检的病料和猪瘟兔化弱毒疫苗中扩增出一2 5 2 bp的特异片段 ,从长岭地区的疑似猪瘟病猪的血清病料中 ,同时扩增出 32 6 bp和 2 5 2 bp的核酸片段 ,表明长岭某猪场流行的“猪瘟”为 BVDV和 HCV混合感染。本研究为进行 HCV和 BVDV的鉴别诊断与流行病学调查提供了有效的方法。     

猪瘟病毒RT-PCR核酸检测与ELISA抗原检测试验应用研究

本试验根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株E2基因序列,设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的PCR引物。以120份疑似猪瘟病料为试验材料,使用RT-PCR核酸检测与ELISA抗原检测2种方法,分别用这2种方法检测疑似病料,并且比较这2种方法在猪瘟病料检测中的实际差别。通过猪瘟病毒RT-PCR核酸检测结果及ELISA抗原检测结果相互印证,为云南猪瘟的诊断及防制提供了技术支持。     

鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒的研制

用特定引物通过PCR合成了经地高辛标记的鸡致病性外源性及内源性禽白血病病毒特异性核酸探针,通过交叉斑点分子杂交,这些探针将可用于检测病料样品中致病性外源性禽白血病毒特异性核酸的存在。利用此试剂盒,对从病料组织样品中提取的基因组DNA作交叉斑点分子杂交或对提取的DNA用相应引物扩增后的PCR产物作交叉斑点分子杂交,可在24～36h内完成检测并报告结果。     

多重荧光PCR鉴别诊断猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒

为了建立一种快速、灵敏、特异的能够同时检测猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的多重荧光PCR方法。根据GenBank中公布的猪瘟病毒基因序列,设计一套特异性的引物和探针,对猪瘟病料提取RNA,经RT—PCR扩增后将产物回收,克隆至pMDl8-T构建pMDl8-T—CSFV阳性质粒;非洲猪瘟的目的片段序列采用化学合成,构建pMDl8-T—ASFV阳性质粒。以两种阳性质粒为模板时建立的多重荧光PCR方法做特异性、灵敏度和重复性试验,结果表明该方法可以将猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒同口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪水泡病病毒、猪圆环病毒2型区分开,灵敏度可以达到10拷贝的数量级．而且方法稳定。对2份已知猪瘟阳性血清样品和120份猪内脏、猪鼻腔拭子及血清样品检测后．发现对已知阳性样品的检测结果符合预期目标。未知样品检出猪瘟病毒3份阳性,未检出非洲猪瘟病毒阳性。     

RT-PCR快速检测猪繁殖与呼吸综合征临床组织样品的研究

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列 ,在其核衣壳蛋白基因 (ORF7)保守区设计了一对跨幅约 380bp的特异性引物N1/N2 ,对已知PRRSVJK10 0 1毒株和PRRS临床病料进行RT PCR扩增 ,均扩增出约 380bp的特异片段。用此方法检测 5份疑似PRRS病例肺组织病料 ,结果均为阳性 ,对 2个阳性样品扩增产物进行克隆、测序 ,全长均为 372bp ,与PRRSVVR 2 332毒株ORF7同源性为 95%,证实为PRRSV的核衣壳蛋白基因。结果表明 ,建立的RT PCR检测PRRS临床组织病料特异、快速 ,可用于PRRS临床病料检测     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5＇端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针，建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株，未能检测出牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞；对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析，与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50／mL，整个试验流程只需2h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本，两种方法的检出率分别为17．4％和13．5％，两者符合率为95．7％（198／207）；荧光RT-PCR的检出率高于ELISA，两者差异显著。结果表明，建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法的建立

本研究旨在建立猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法。根据Shimen株设计1对特异性引物,建立猪瘟病毒RT-PCR-RFLP检测方法;对20份疑似猪瘟临床样品进行检测,并对检出的山东8株流行野毒株和2株疫苗株PCR产物进行克隆与序列分析,验证上述方法。结果RT-PCR扩增片段为825bp,产物经RFLP分析,野毒株的PCR产物能被ApaⅠ酶切为322bp和503bp 2个片段,兔化弱毒疫苗株则不能被酶切,检测出RNA的最低浓度为0.028 6μg.mL-1;8株流行野毒株都含GGGCCC序列(ApaⅠ酶切位点),2株疫苗株相应序列为GAGCCC,不能被ApaⅠ酶切;8株流行野毒株属于基因2群,2株疫苗株与HCLV遗传关系近,为基因1群。建立了可鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP检测方法,为猪瘟的防控提供有效手段。     

传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测与分型技术

根据已发表的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)核苷酸序列 ,在病毒结构蛋白 VP2编码基因的高变区两端外侧的保守序列内设计合成了 2条寡核苷酸引物 ,对各种不同致病性的 12株参考毒株进行了 RT- PCR检测。结果 :12个参考毒株均能扩增出约 6 79bp的目的片段 ,而对照的 5种鸡源性病原体 NDV、IBV、CAIV、E.coli、PM均未扩增到相应片段 ;对疑似 IBD的 34份临床病料进行检测 ,并同时在其扩增的片段内设计另 1对引物进行 Nested- PCR检测 ,结果基础 RT- PCR检测到 11份阳性 ,Nested- PCR检测到 2 3份阳性 ,后者的检出率大大提高。结果表明 ,建立的 RT- PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点。取限制性内切酶 Sac 和 Ssp 以及设计的 2条 vv IBDV(超强毒株 )特异性引物 ,分别应用 v VP2片段 PCR扩增产物的限制性内切酶分析和型特异性引物的 PCR扩增 2种方法 ,对 7个 IBDV分离参考毒株和 2 4个临床样品进行致病性分型。结果 ,确定 2 1株属于 c IBDV(经典毒株 ) ,8株属于 vv IBDV,2株未能确定 ;2种分型方法的结果基本一致 ,均可用于 IBDV的快速分型 ,型特异性引物的 PCR扩增方法更为简便和快捷     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。     

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

为建立非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,以非洲猪瘟病毒P72蛋白编码基因为靶基因设计引物和探针,利用正交试验方法优化反应体系及扩增程序,建立了非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,并对其敏感性、特异性及稳定性进行评估。结果显示:建立的方法最低检出限为0.58 copies/μL,与荧光PCR方法相比更敏感;本方法与布鲁氏菌、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒无交叉反应;对10倍稀释的标准物质检测10次,变异系数为8.44%,重复性好。利用建立的方法对100份临床样品进行检测,结果均为阴性,与荧光PCR检测结果一致;对5份实验室间比对样品进行检测,检测出阳性样品4份,阴性样品1份,与实验室间比对给定的样品盘结果一致。结果表明,本研究建立的微滴式数字PCR方法的敏感性、特异性和稳定性符合要求,适于非洲猪瘟病毒临床检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中已登录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在Nsp7基因中的保守区域设计合成了1对特异性引物,通过反应条件的优化,建立了检测美洲型PRRSV的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法,同时与商品化荧光定量PCR试剂盒进行比对分析。结果表明,该方法特异性强,灵敏度高,能很好的区分美洲型猪繁殖与呼吸道综合征病毒和其他病毒。使用该方法对14份临床样品进行检测,阳性率85.7%,与商品化试剂盒符合率100%。     

7种猪场常见高致死病原GeXP检测方法的建立

本研究旨在建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、坏死梭杆菌(Fn)和副猪嗜血杆菌(Hps)7种猪场常见高致死性流行病原的多重PCR检测方法。利用7种病原体的保守序列设计7对特异性引物,同时合成了Cy-5标记的通用引物。将通用引物分别连接到特异性引物的5′端形成7对特异性嵌合引物。优化反应条件,分别使用7组嵌合引物和通用引物混合,扩增7种病原的混合cDNA/DNA,验证其单重PCR的特异性。利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,混合7种嵌合引物和通用引物,扩增单一病原的cDNA/DNA,验证其多重PCR特异性;将其他常见猪病病原的基因组作为干扰的阳性标本,利用7对混合嵌合引物和通用引物进行多重PCR分析,扩增加入了阳性标本的混合模板,验证其多重PCR的抗干扰能力。利用重组质粒和体外转录的RNA进行梯度稀释,确定GeXP多重检测体系的灵敏度。结果表明,7种不同引物分别进行GeXP单重及多重检测,均能检测出特异性目的片段的信号,无明显的干扰片段信号出现;GeXP多重检测抗干扰试验结果显示,在混入3种干扰病原模板后,依然可同时特异性检测出7种病原;GeXP多重检测灵敏度分析显示,在10~3拷贝/μL浓度条件下能检测到7种不同基因的特异性结果。本研究建立的同时检测7种猪场常见高致死性流行病原的GeXP检测方法具有高通量、高特异性和高灵敏度的特点,为快速诊断猪流行性疾病的交叉感染和混合感染提供了新型的检测方法。     

猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。     

从疑似猪瘟病料中检出牛病毒性腹泻病毒

根据牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）ＮＡＤＬ株和猪瘟病毒（ＨＣＶ）Ａｌｆｏｒｔ株的核苷酸序列，设计合成了１对ＢＶＤＶ引物和３对ＨＣＶ引物。以从吉林、长春、哲盟３个地区经临床及病理学诊断为猪瘟的病料中提取的ＲＮＡ为模板，采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），分别以ＢＶＤＶ和ＨＣＶ引物进行扩增。结果，用ＢＶＤＶ引物从哲盟地区的疑似猪瘟病料中扩增出大小约４００ｂｐ的片段，而用３对ＨＣＶ引物在不同的条件下均未从该病料中扩增出相应大小的ＨＣＶ基因片段。此外，用ＨＣＶ的ＰＥ０／ＰＥ４引物从吉林、长春的病料中扩增出了ＨＣＶ的基因片段，但用ＢＶＤＶ引物从这两个地区的病料中均未扩增出ＢＶＤＶ的基因片段。从哲盟疑似猪瘟病料中扩增出的片段经克隆、序列测定及计算机分析证实，该片段的核苷酸序列和氨基酸序列与ＢＶＤＶ的同源性明显高于与ＨＣＶ的同源性。将哲盟病料接种于ＭＤＢＫ传代细胞，出现典型而规律的ＢＶＤＶ样细胞病变。由此证明，从哲盟疑似猪瘟病料中检测出的是ＢＶＤＶ而不是ＨＣＶ     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟疫苗病毒含量

为建立一种能够快速定量检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法。对GenBank登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守的5′端非编码区设计1对针对猪瘟兔化弱毒疫苗的特异性引物,扩增片段为245 bp,且不与牛病毒性腹泻病毒以及其他猪源病毒发生非特异性反应。应用实时荧光定量RT-PCR法对16份猪瘟脾淋苗和细胞苗进行定量检测,结果表明,102拷贝/μL的总RNA即能得到特异性扩增,在107~102拷贝/μL线性范围内有良好的扩增曲线,并与兔体定型热反应有良好的相关性。该法具有敏感性、特异性、重复性好等优点,可望取代传统的兔热法用于猪瘟疫苗生产过程中的效价测定及指导疫苗的配制,也为猪瘟病毒分子生物学研究提供一种新的有效工具。     

用套式PCR方法对几种猪用冻干疫苗的PCV2检测

参照Genbank已发表的猪圆环病毒2型的基因序列,取其比较保守的基因片段ORF2,利用引物设计软件Oli-go5.0设计两对PCV2型特异的引物,其中第一对引物扩增跨度为ORF2全基因片段,长度为702 bp,第二对引物扩增ORF2中间的一个小片段,跨度大小为494 bp.首先用第一对引物扩增阳性DNA,阳性DNA的浓度从10-1稀释到10-11,然后以第一次PCR产物为模板,用第二对引物进行PCR,发现这种套式PCR的方法比用普通PCR灵敏度提高102倍.同这种套式PCR方法对广东省市场上出售的几种猪用弱毒疫苗进行猪圆环病毒2型检测,结果发现这几种疫苗全部为阴性,本实验说明目前广东市场上出售的弱毒疫苗在制作过程中没有受到PCV2的污染,解除了广大猪场主的顾虑.     

牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻/粘膜病病毒5'端非结构蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,建立检测牛病毒性腹泻/粘膜病病毒244 bp片段的RT-PCR一步法。该方法对牛病毒性腹泻/粘膜病病毒NADL、OregonC24V和长春184毒株各标准毒株检测,结果均为阳性。对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达0.1 TCID50;而对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的细胞培养物进行检测,结果均为阴性。检测460份不同样品,与病毒分离试验比较,符合率100%,证明该方法特异性强,敏感性高。初步结果表明所建立的一步法RT-PCR技术可用于牛病毒性腹泻/粘膜病的检测及流行病学调查。     

多重PCR结合基因芯片技术检测5种猪繁殖障碍性病毒病方法的研究

为建立运用多重PCR和基因芯片技术同时检测5种猪繁殖障碍性病毒病的方法。本研究根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪日本乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列设计特异性引物与探针,制备相应的寡核苷酸芯片,检测了5种猪繁殖障碍性疾病病毒的标准毒株,并对16份临床样品进行检测。通过多重PCR扩增出带有荧光标记的5种病毒的特异性基因片段,并与固定有特异性探针的基因芯片杂交。结果显示,本研究建立的多重PCR结合基因芯片检测方法特异性强、稳定性好,灵敏度可达10~2拷贝/μL。16份临床样品检测结果显示阳性率达87.5%(14/16)。以上结果表明该方法特异性好、灵敏度高,可高效检测以上5种病毒,为其临床诊断及流行病学调查提供了有效的检测方法。     

A型猪流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据WHO推荐的检测A型猪流感病毒的引物和探针序列,建立了A型猪流感病毒实时荧光定量PCR检测方法。使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,检测结果表明,该方法的敏感性可达100拷贝/25μL反应体系,显示出良好的敏感性和重复性,临床上已用于实验室鼻拭子样品的检测,并成为一种快速定量检测A型猪流感病毒的方法。     

PCR用于鸭瘟病毒诊断的研究

根据鸭瘟病毒UL6和UL7基因序列,设计合成了一对引物,以2株疫苗株、1株强毒株和1株山东分离株DNA为模板,进行PCR扩增,得到预期690bp的目的片段.将扩增的目的片段克隆到pMD18-T载体,经Amp平板筛选,HindⅢ、BamHⅠ双酶切鉴定,获得阳性重组质粒.对重组质粒进行序列测定,与参考序列比较,山东分离株与参考序列的同源性为99.7%,其余3株DPV与参考序列的同源性均为100%.应用PCR可检测人工感染和自然感染鸭瘟的组织中的鸭瘟病毒,表明PCR检测鸭瘟病毒具有很高的特异性、敏感性,该法能够用于鸭瘟急性及亚临床感染的检测与诊断.