猪流行性腹泻病毒通过miR-133c-3p/BCL2L2轴调控细胞凋亡

旨在探讨miR-133c-3p在猪流行腹泻病毒（PEDV）引起的细胞凋亡过程中所起的作用,并探讨其发挥作用的机制。以PEDV感染MARC-145细胞为模型,检测PEDV感染过程中细胞的凋亡情况以及6个与凋亡相关microRNAs的表达差异,RT-qPCR检测PEDV感染过程中与凋亡相关microRNAs的表达差异,合成miR-133c-3p的模拟物和抑制剂,转染MARC-145细胞,采用流式细胞术检测PEDV感染MARC-145细胞的凋亡情况,流式细胞术检测过表达和敲低miR-133c-3p后细胞的凋亡情况,采用生物信息学方法预测miR-133c-3p的靶基因,荧光素酶报告基因检测了miR-133c-3p和靶基因的结合情况,Western blot检测了过表达miR-133c-3p对BCL-w和PEDV蛋白表达水平的调控,用siRNA敲低BCL-w蛋白检测细胞凋亡情况。结果显示,PEDV的感染可以诱导MARC-145细胞凋亡（P<0.05）,与凋亡相关的microRNAs,如miR-133c-3p和miR-149-5p的表达上调（P<0.05;P<0.001）,miR-138-3p的表达下调（P<0.05）。其中,miR-133c-3p在病毒感染后升高了约5倍（P<0.01）。过表达miR-133c-3p后,细胞凋亡率显著升高（P<0.01）;敲低miR-133c-3p后,细胞凋亡率降低（P<0.05）。用生物信息学方法预测miR-133c-3p与BCL2L2的3'UTR区域有结合位点,荧光素酶报告基因试验显示miR-133c-3p可以和BCL2L2基因靶向结合（P<0.01）,过表达miR-133c-3p后细胞内BCL-w蛋白的表达明显下调,且病毒的感染可以降低BCL-w的表达水平,敲低BCL-w后细胞凋亡率显著升高（P<0.01）。PEDV感染后可以通过上调miR-133c-3p的表达来下调BCL2L2的表达,从而促进细胞的凋亡。     

猪miR-23a靶向调控Smad3基因表达的研究

为了确定miR-23a是否靶向调控Smad3基因,试验利用NotⅠ和XhoⅠ酶构建包含Smad3-3′-UTR的野生型(psiCHECKTM-2-W-Smad3-3′-UTR)和突变型双荧光酶报告载体(psiCHECKTM-2-M-Smad3-3′-UTR),并在PK-15细胞中转染miR-23amimics、miR-23ainhibitor及其阴性对照,采用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,用实时荧光定量PCR和Western blotting法分别检测Smad3基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含Smad3-3′-UTR的野生型和突变型双荧光酶报告载体与miR-23amimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P<0.05);转染miR-23amimics能显著下调Smad3基因mRNA及其蛋白表达水平(P<0.05);而转染miR-23ainhibitor组与miR-23ainhibitor阴性对照组相比,Smad3基因蛋白表达差异不显著(P>0.05)。综合上述结果可知,猪miR-23a可靶向作用于Smad3基因。     

miR-145-4调控蛋鸭卵泡发育机制的研究

【目的】 本研究旨在揭示miR-145-4在蛋鸭卵泡发育中的作用及调控机制。【方法】 分离培养蛋鸭卵泡颗粒细胞,转染miR-145-4相似物（mimic）、抑制物（inhibitor）后,利用实时荧光定量PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因的表达情况,采用RNAhybrid和Targetscan程序预测miR-145-4的靶基因及其与靶基因磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA）3'-UTR的结合位点,分别构建PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,与miR-145-4 mimic和mimic-NC共转染蛋鸭卵泡颗粒细胞后,采用双荧光素酶报告系统验证miR-145-4与靶基因PIK3CA的结合关系,最后采用实时荧光定量PCR法检测miR-145-4对蛋鸭卵泡颗粒细胞中PIK3CA基因表达的影响。【结果】 实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达miR-145-4后CyclinB2基因的表达量极显著降低（P<0.01）,BCL2基因的表达量极显著增加（P<0.01）;抑制miR-145-4后,CyclinB2基因表达量极显著升高（P<0.01）,BCL2基因表达量极显著降低（P<0.01）。预测结果显示,miR-145-4与PIK3CA基因3'-UTR存在结合位点。PCR扩增和测序结果显示,PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型载体构建成功。双荧光素酶检测结果显示,与突变型及空载体共转染组相比,野生型组双荧光素酶活性显著降低（P<0.05）,说明miR-145-4能够与PIK3CA基因3'-UTR结合。实时荧光定量PCR结果表明,在蛋鸭卵泡颗粒细胞中过表达miR-145-4后,PIK3CA基因表达量显著降低（P<0.05）,而抑制miR-145-4后,PIK3CA基因表达量极显著升高（P<0.01）。【结论】 miR-145-4通过正向调控靶基因PIK3CA促进蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡,进而调控蛋鸭的卵泡发育。     

绵羊miR-127/FOXO4反馈环路及其对卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响

旨在研究oar-miR-127/FOXO4反馈环路及其对绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用Promoter 2.0预测绵羊miR-127启动子,利用JASPAR数据库预测转录因子FOXO4与oar-miR-127启动子区的结合位点,构建包含预测结合位点的pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体;利用TargetScan软件在线预测oar-miR-127与FOXO4基因3'-UTR区结合位点,构建包含预测结合位点的pmir-GLO-FOXO4野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组质粒;将pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体共（或单独）转染体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞,FOXO4突变型、野生型和缺失型重组质粒与miR-127 mimic/mimic NC共转染体外培养的293T细胞,48 h后检测荧光素酶活性;pcDNA-FOXO4过表达载体（miR-127 mimic/mimic NC）转染绵羊卵泡颗粒细胞48 h,利用qRT-PCR检测miR-127（FOXO4）及凋亡基因（Casp3、Bax及BCL2）的表达水平。过表达转录因子FOXO4显著降低了oar-miR-127启动子相对荧光素酶活性（P<0.05）和oar-miR-127表达水平（P<0.05）;miR-127 mimic和FOXO4野生型重组质粒共转染的颗粒细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-127 mimic和FOXO4缺失/突变型重组质粒的细胞（P<0.05）。转染miR-127 mimic的颗粒细胞中FOXO4表达量显著降低（P<0.05）,Casp3和Bax基因表达水平极显著升高（P<0.001）;过表达转录因子FOXO4的颗粒细胞中Casp3和Bax的表达水平无显著变化（P>0.05）,但BCL2相对表达量显著降低（P<0.05）。本研究证实了oar-miR-127与靶基因FOXO4间存在反馈环路,并促进绵羊卵泡颗粒细胞的凋亡,为研究其在绵羊卵泡发育中的作用机制奠定了基础。     

miR-188对小鼠乳腺癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

【目的】 探讨microRNA-188-5p （miR-188）在乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡过程中的调控作用，以期为乳腺癌相关治疗药物的研发提供理论依据。【方法】 培养小鼠乳腺癌细胞（4T1），建立4T1细胞小鼠移植瘤模型，分离肿瘤组织和瘤旁组织，用实时荧光定量PCR法检测miR-188的表达情况；在4T1细胞中分别转染miR-188的模拟物（miR-188 mimics）、模拟物对照（mimics-NC）、miR-188抑制物（miR-188 inhibitor）及抑制物对照（inhibitor-NC），不转染的细胞为空白对照（Con），用实时荧光定量PCR法检测各组细胞miR-188的表达水平，CCK-8法检测细胞增殖能力，细胞划痕试验检测细胞的迁移率，流式细胞术检测细胞的凋亡率，Western blotting检测细胞相关凋亡蛋白的表达情况。【结果】 瘤旁组织中miR-188的相对表达量显著高于肿瘤组织（P<0.05）；细胞转染结果表明，与Con组相比，miR-188 mimics组miR-188的相对表达量显著上调（P<0.05），而miR-188 inhibitor组显著下调（P<0.05），mimics-NC、inhibitor-NC组均无显著差异（P>0.05），因此后续试验分别以mimics-NC、inhibitor-NC为miR-188 mimics、miR-188 inhibitor的对照进行分析。细胞增殖和划痕试验结果表明，与mimics-NC组相比，miR-188 mimics显著降低4T1细胞的增殖速率和迁移速率（P<0.05）；细胞凋亡试验结果显示，与mimics-NC组相比，miR-188 mimics显著促进4T1细胞凋亡（P<0.05）；与inhibitor-NC组相比，miR-188 inhibitor显著抑制细胞凋亡（P<0.05）；Western blotting结果表明，miR-188 mimics显著降低基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白的表达水平（P<0.05），显著提高聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP1）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和Bcl-2-associated X蛋白（Bax）的表达、抑制抑凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）的表达（P<0.05）。【结论】 miR-188可显著抑制4T1细胞的增殖和迁移，促进4T1细胞凋亡，说明miR-188可以作为抑制乳腺癌进展和转移潜能的肿瘤调节子。     

褪黑素核受体RORα对小鼠睾丸间质细胞凋亡的作用

为研究核受体RORα对小鼠睾丸间质细胞凋亡的作用,实验使用褪黑素(MT)、核受体RORα拮抗剂SR1001、MT+SR1001、无血清培养液处理小鼠睾丸间质细胞36 h,检测细胞活力、细胞凋亡率以及凋亡相关基因Bcl2、Bax mRNA表达量。结果表明:与对照组相比,褪黑素可极显著降低细胞凋亡率、提高细胞活力及抗凋亡基因Bcl2 mRNA表达量(P<0.01),抑制促凋亡基因Bax mRNA表达量(P<0.05);与MT组相比,MT+SR1001处理后细胞活力(P<0.05)及Bcl2表达量(P<0.01)降低,细胞凋亡率极显著上升(P<0.01),Bax表达量显著上升(P<0.05)。结果提示,褪黑素可通过RORα途径抑制小鼠睾丸间质细胞凋亡。     

水牛miR-16b过表达腺病毒载体构建及生物信息学分析

试验旨在对水牛pri-miR-16b基因进行克隆并构建腺病毒表达载体，且对水牛miR-16b及其预测靶基因进行生物信息学分析，为研究其在水牛卵母细胞成熟过程中的作用奠定基础。利用RT-PCR技术从水牛卵巢基因组中扩增pri-miR-16b基因，采用同源重组的方法构建pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b质粒；利用BLAST程序进行同源性分析，Mega 7.0构建系统进化树，ViennaRNA Web Services预测pre-miR-16b的二级结构。对腺病毒质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxdelE13cre进行包装，经过3次扩增获得含有pri-miR-16b的腺病毒颗粒，将获得的病毒颗粒命名为Ad-miR-16b，并进行病毒滴度测定；利用Ad-miR-16b感染水牛卵丘细胞，实时荧光定量PCR检测miR-16b在卵丘细胞中的表达情况。利用TargetScan对miR-16b进行靶基因预测，对预测的靶基因进行KEGG通路富集。结果显示，试验成功克隆水牛pri-miR-16b序列，通过比对发现与牛的序列相似性分别为100%，与其他物种同源性较高，和黄牛的亲缘关系最近。ViennaRNA Web Services预测结果显示，pre-miR-16b的二级结构具有典型的单一茎环结构。试验成功获得Ad-miR-16b腺病毒颗粒，病毒滴度为3.367×10¹⁰ GFU/mL，感染卵丘细胞后，实时荧光定量PCR检测发现miR-16b的表达量极显著升高（P<0.01）。对miR-16b预测的1 394个靶基因进行KEGG通路富集分析，发现miR-16b可能主要通过调控卵丘细胞中MAPK、TGF-β及PI3K/AKT等74条信号通路进而在卵母细胞成熟过程中发挥作用。     

结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对RAW264.7细胞凋亡的影响

试验旨在研究结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分枝杆菌Rv2626c基因序列设计引物,并以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板,PCR扩增Rv2626c基因并克隆至慢病毒表达载体pLEX-EGFP中,包装慢病毒并感染RAW264.7细胞,使用Western blotting和流式细胞仪技术检测Rv2626c蛋白表达水平和RAW264.7细胞凋亡率变化。结果显示,成功构建慢病毒表达载体pLEX-EGFP-Rv2626c;成功包装慢病毒并感染RAW264.7细胞;Rv2626c蛋白在RAW264.7细胞中高水平表达显著促进了细胞凋亡。本试验结果表明,在RAW264.7细胞中过表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白能显著性增加其凋亡水平。     

miR-93对延边黄牛垂体细胞GH分泌的影响

为了分析血液外泌体miRNA对延边黄牛垂体细胞生长激素（GH）分泌的影响,试验选择在延边黄牛和韩延牛血液外泌体中存在显著差异表达的miR-93,分析其对延边黄牛垂体细胞GH分泌的影响机制。试验首先进行延边黄牛垂体细胞的原代培养,之后将miR-93的mimics（miR-93-mi组）、mimics对照品（NC对照组）、inhibitor（miR-93-in组）、inhibitor对照品（iNC组）转染给已建立的垂体原代细胞,48 h后收集细胞,提取总mRNA和总蛋白。试验利用targetscan和RNAhybrid分析软件对miR-93的靶基因进行预测,并利用双荧光素酶报告基因系统对miR-93的靶关系进行验证;利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测靶基因mRNA转录和蛋白的表达情况,结果表明,miR-93靶向了生长激素释放激素受体（GHRHR）的3'UTR;与NC对照组比较,miR-93-mi组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达均极显著低于NC对照组（P<0.01）;miR-93-mi组的GHRH mRNA转录和蛋白表达均极显著低于NC对照组（P<0.01）,而miR-93-in组的GHRHR蛋白表达显著高于iNC对照组（P<0.05）。说明miR-93可通过调节GHRHR的表达而调控延边黄牛垂体细胞GH的分泌,进而调控延边黄牛的生长发育。     

miR-17-3p Regulates Preadipocyte Differentiation by Targeting KCTD15 in Yanbian Yellow Cattle

The aim of this study was to explore whether miR-17-3p could target KCTD15 to regulate the preadipocytes differentiation of Yanbian Yellow cattle. Bioinformatics softwares were used to identify homology and predict target genes of miR-17-3p. miR-17-3p mimic or miR-17-3p inhibitor and their negative control were transfected into bovine preadipocytes to overexpress or inhibit the expression of miR-17-3p. The binding sites of miR-17-3p to KCTD15 were verified via double luciferase report system. qRT-PCR and Western blot were used to detect the effect of miR-17-3p on the expressions of PPARγ, C/EBPα and KCTD15 both at mRNA and protein levels. Bioinformatics software prediction showed that KCTD15 was the target gene of miR-17-3p, and miR-17-3p had high homology in mammals. The mRNA and protein expressions of adipogenic marker genes PPARγ and C/EBPα after transfection of miR-17-3p mimic were significantly or extremely significantly higher than those of the control group transfected with NC-mimic (P<0.05 or P<0.01). After the expression of miR-17-3p was inhibited, the expressions of PPARγ and C/EBPα were significantly or extremely significantly lower than that in the control group (P<0.05 or P<0.01). Through the dual-luciferase reporter assay verification, the overexpression of miR-17-3p extremely significantly inhibited the fluorescent activity of the luciferase reporter gene vector containing the 3'UTR fragment of KCTD15 (P<0.01). Overexpression of miR-17-3p could also significantly or extremely significantly inhibit the expression of KCTD15 mRNA and protein(P<0.05 or P<0.01). However, inhibition of miR-17-3p expression could significantly increase the expression of KCTD15 mRNA and protein(P<0.05). These results suggest that miR-17-3p may regulate the differentiation of preadipocytes in Yanbian Yellow cattle by inhibiting the expression of KCTD15.     

miR-17-3p靶向KCTD15调控延边黄牛前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-17-3p是否可以通过靶向KCTD15调节延边黄牛前体脂肪细胞的分化。本研究使用生物信息学软件鉴定miR-17-3p的同源性，预测miR-17-3p的靶基因；通过在延边黄牛的前体脂肪细胞中转染miR-17-3p mimic或miR-17-3p inhibitor及阴性对照实现细胞内miR-17-3p过表达或抑制表达；采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-17-3p与KCTD15的靶标关系；使用qRT-PCR和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上检测miR-17-3p对KCTD15基因以及脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα表达水平的影响。结果表明，生物信息学软件预测KCTD15可作为miR-17-3p的靶基因，且miR-17-3p在哺乳动物中具有较高的同源性；转染miR-17-3p mimic后脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα的mRNA和蛋白表达量显著或极显著高于转染NC-mimic的对照组（P<0.05或P<0.01）；抑制miR-17-3p的表达后，PPARγ和C/EBPα的表达量则显著或极显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）；双荧光素酶报告基因验证分析显示，过表达miR-17-3p极显著抑制了含有KCTD15 3'UTR片段的载体的荧光活性（P<0.01）；过表达miR-17-3p也会显著或极显著抑制候选靶基因KCTD15 mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05或P<0.01）；而抑制miR-17-3p的表达则会显著提高靶基因KCTD15的mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05）。这些结果说明，miR-17-3p可能通过抑制KCTD15的表达促进延边黄牛前体脂肪细胞分化。     

bta-miR-205和bta-miR-497调控牛病毒性腹泻病毒复制的研究

为探究bta-miR-205和bta-miR-497对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)复制的调控作用,在前期建立BVDV感染MDBK细胞miRNAs差异表达谱的基础上,筛选出表达量显著差异的bta-miR-205和btamiR-497,通过生物信息学软件预测、荧光素酶报告基因检测等方法鉴定bta-miR-205和bta-miR-497的靶基因。应用RT-qPCR和病毒滴度测定等方法验证bta-miR-205和bta-miR-497对BVDV复制的影响。结果发现,bta-miR-205能显著抑制BVDV的复制,而bta-miR-497显著促进BVDV的复制。研究结果为BVD防控提供了新的思路和依据。     

血小板凝血酶蛋白1对犬乳腺肿瘤细胞体外生物学特性的影响分析

本研究旨在深入探讨血小板凝血酶蛋白1(THBS1)对犬乳腺肿瘤细胞CHMp的影响,并阐明其影响犬乳腺肿瘤发生发展的作用机制。通过构建THBS1慢病毒稳定过表达和THBS1沉默表达的犬乳腺肿瘤细胞CHMp细胞系,采用CCK-8试验、划痕试验、Transwell试验、原位荧光检测和流式细胞术检测THBS1对CHMp细胞增殖、迁移、侵袭、细胞凋亡和细胞周期情况的影响;通过qRT-PCR和Western blot检测THBS1对CHMp细胞凋亡相关因子(p53、Bcl-2、Bax)表达情况的影响,验证THBS1对CHMp细胞凋亡通路的影响。结果显示,过表达THBS1能有效增强犬乳腺肿瘤细胞CHMp的增殖、迁移和侵袭能力,并且减少CHMp细胞的凋亡数量,而沉默THBS1后结果与之相反;流式细胞术得出THBS1能够影响CHMp细胞的细胞周期分布;经qRT-PCR和Western blot检测发现,在THBS1过表达后,p53和Bcl-2的表达量均明显增高,Bax的表达量明显减少,在沉默THBS1后结果与之相反。结果表明,THBS1的异常表达能够影响犬乳腺肿瘤细胞CHMp的增殖、迁移、侵袭以及细胞周期;此外,THBS1能够通过影响细胞凋亡因子p53、Bcl-2和Bax的表达来影响CHMp细胞凋亡相关通路,进而影响犬乳腺肿瘤的发生发展。     

鸡软骨细胞体外分离培养鉴定以及过表达miR-15a对软骨细胞的影响

为分析miR-15a在肉鸡不同组织中的表达情况,并探究过表达miR-15a对体外培养鸡软骨细胞的影响。本研究首先通过倒置显微镜观察、PCR、凝胶电泳和甲苯胺蓝染色对体外分离培养的软骨细胞进行鉴定。通过实时荧光定量PCR检测miR-15a在肢体内外翻畸形(valgus-varus deformity, VVD)组和健康组肉鸡中(各3只)各组织的表达量。之后通过CCK8和EDU方法分析软骨细胞过表达miR-15a后细胞增殖情况。软骨细胞转染miR-15a mimics后,通过qPCR检测软骨细胞的标志基因Collagen-2、Aggrecan、Collagen-10,成熟分化基因Runx2、Sox9、VEGF、MMP9,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β3以及凋亡基因Fas、FasL、Bcl-2的表达量。并构建FKBP5 3'UTR的野生型载体和突变型载体,通过双荧光素酶检测报告检测miR-15a与FKBP5的靶向关系。结果表明,本研究所用的胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法成功分离得到状态良好的软骨细胞。荧光定量结果显示,miR-15a在各组织中均有表达,与健康组相比,miR-15a在VVD组的肝(P < 0.01)、脾(P < 0.05)、胸腺(P < 0.01)中的表达量显著升高,在心和胸肌组织中的表达量显著降低(P < 0.01)。CCK8与EDU分析结果显示,与NC组相比,过表达miR-15a组软骨细胞增殖速度显著降低(P < 0.01),增殖细胞数量显著减少(P < 0.01)。qPCR结果显示,与mimics NC组相比,miR-15a mimics组的软骨细胞标志基因Aggrecan、成熟分化基因Sox9、Runx2表达量显著降低(P < 0.05),Fas基因表达量极显著上升(P < 0.01),FasL基因和抗凋亡基因Bcl-2极显著下降(P < 0.01)。成功构建了FKBP5 3'UTR野生型和突变型载体,双荧光素酶检测报告结果显示预测的靶基因FKBP5与miR-15a没有靶向关系。本研究成功分离并鉴定了鸡软骨细胞,过表达miR-15a抑制鸡软骨细胞增殖、成熟和分化并促进细胞凋亡。     

断喙应激对雏鸡胸腺细胞凋亡及相关凋亡蛋白表达的影响

为研究断喙应激对雏鸡胸腺细胞凋亡及相关凋亡蛋白表达的影响,采用电子显微镜技术、流式细胞术和免疫组织化学技术分析断喙对鸡胸腺淋巴细胞的细胞增殖、分化、凋亡及相关凋亡蛋白(Bcl-2和Bax)表达的影响.结果表明:采用电子显微镜技术观察到断喙对胸腺淋巴细胞产生明显的影响,断喙组胸腺细胞内可看到细胞核明显的应激反应,细胞核凝集,较致密,部分细胞核即将溶解,并出现一定数量的凋亡和坏死细胞;流式细胞仪检测表明对照组和断喙组的胸腺内淋巴细胞都是以G1期为主,但断喙组G1期淋巴细胞数量比试验组高;对照组和断喙组胸腺淋巴细胞凋亡率在断喙后5d时差异显著(P＜0.05);免疫组化结果表明断喙应激没有影响Bcl-2和Bax蛋白在免疫器官内的表达部位;但有降低Bcl 2在胸腺细胞内表达量的趋势;有提高Bax在胸腺细胞内表达量的趋势.结果表明断喙应激促进了雏鸡胸腺淋巴细胞凋亡.     

miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞成脂分化调控的研究

【目的】 探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】 通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性；实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达；利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，并进行GO和KEGG富集分析；使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体，并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞，进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系，测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物（miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics）、抑制物（miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor）、阴性对照（NC）及其靶基因的干扰siRNA （Gene-siRNA），转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后，分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况，油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】 保守性分析结果表明，miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性；miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示，miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达；靶基因预测结果表明，miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶（GPD2）和环腺苷酸反应元件（CREB1）；GO和KEGG功能富集分析发现，miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成，调节脂肪细胞分化，且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<－87.8 kJ/mol；双荧光素酶报告基因试验结果表明，转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3'-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性（P<0.01），但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明，与未分化脂肪细胞（0 d）相比，miR-181a表达量在分化的第4天显著升高（P<0.05），到第6天达到极显著差异（P<0.01）；miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高（P<0.01）。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果，与NC组相比，mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升（P<0.01），inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降（P<0.01）；mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降（P<0.01），inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升（P<0.01）；mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升（P<0.05；P<0.01），inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降（P<0.05）；油红O染色结果表明，与NC组相比，mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加，inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】 miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3'-UTR区域序列，降低GPD2和CREB1基因的表达，促进猪前体脂肪细胞成脂分化。     

miR-140-5p对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的机制研究

【目的】研究miR-140-5p在前脂肪细胞（3T3-L1）成脂分化过程中的功能及其作用机制。【方法】待3T3-L1细胞汇合度达100%时诱导其成脂分化，收集分化第―1（诱导分化前1 d）、0、1、2、3、5、7天的细胞，用实时荧光定量PCR检测miR-140-5p相对表达量；将miR-140-5p mimics、NC转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化，油红O染色观察脂滴形成情况，实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白β（C/EBPβ）、CAAT增强子结合蛋白δ（C/EBPδ）与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）相对表达量；利用miRandn和TargetScan在线网站预测miR-140-5p的靶基因；通过对比序列差异分析P300/CBP相关因子（PCAF）的3'-UTR序列中与miR-140-5p的结合位点序列在小鼠、人等不同物种间的序列保守性。将miR-140-5p mimics、inhibitor、NC转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化，实时荧光定量PCR检测miR-140-5p、PCAF相对表达量，Western blotting检测PCAF蛋白水平；将PEGFP-N1-PCAF、PEGFP-N1转染3T3-L1细胞，油红O染色观察脂滴形成情况，实时荧光定量PCR检测PCAF、C/EBPδ、PPARγ基因相对表达量，Western blotting检测C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ蛋白表达水平。将3条PCAF siRNA（siRNA1、siRNA2、siRNA3）、siRNA NC转染3T3-L1细胞，Western blotting法检测PCAF蛋白水平，筛选最佳PCAF siRNA。将最佳PCAF siRNA和siRNA NC转染3T3-L1细胞，油红O染色观察脂滴形成情况，实时荧光定量PCR检测PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ与PPARγ基因相对表达量，Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ蛋白表达水平。分别将miR-140-5p mimics、NC与PGL0-PCAF 3'-UTR载体和PGLO空载体共转染293T细胞，用双荧光素酶报告试验检测miR-140-5p与PCAF的靶向关系。【结果】在诱导3T3-L1细胞成脂分化过程中，与诱导分化前1 d相比，在细胞成脂分化第1、2天时miR-140-5p相对表达量极显著升高（P＜0.01），在分化第3天时显著升高（P＜0.05）。与NC组相比，miR-140-5p mimics组脂滴数量明显增加，miR-140-5p mimics组成脂标志基因C/EBPδ与PPARγ相对表达量均极显著升高（P＜0.01）。靶基因预测结果表明，miR-140-5p与PCAF存在预期结合位点；保守性分析结果表明，靶基因PCAF结合位点序列在不同物种间具有高度保守性。与NC组相比，mimics组miR-140-5p和PCAF相对表达量均极显著升高（P＜0.01），inhibitor组miR-140-5p极显著降低（P＜0.01）、PCAF显著降低（P＜0.05），PCAF蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。与PEGFP-N1组相比，PEGFP-N1-PCAF组脂滴数量增多，PCAF、PPARγ基因相对表达量和C/EBPβ、C/EBPδ蛋白水平极显著升高（P＜0.01），PPARγ蛋白水平显著升高（P＜0.05）。PCAF siRNA1、siRNA2与siRNA3均极显著抑制PCAF蛋白的表达（P＜0.01），siRNA3的效果最显著，因此选择siRNA3进行后续试验。与NC组相比，PCAF siRNA3组3T3-L1细胞中脂滴数量较少，PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ基因相对表达量和C/EBPβ蛋白水平均极显著下降（P＜0.01）。双荧光素酶报告试验结果显示，miR-140-5p与PCAF基因之间无靶标关系。【结论】内源性miR-140-5p在3T3-L1细胞分化过程中表达升高，miR-140-5p可能通过间接上调PCAF基因表达促进3T3-L1细胞成脂分化。     

猪TLR3基因A1116T点突变功能初步分析

为了确定猪TLR3基因A1116T错义突变的生物学效应,研究其与猪疾病抗性/易感性的关系,本研究采用重叠延伸PCR和定点突变技术构建不同等位基因的真核表达载体,采用双荧光素酶检测分析系统及Real-timePCR方法在体外培养的细胞中研究不同等位基因在信号转导中的作用。成功地构建了野生型和突变型TLR3的真核表达载体,双荧光素酶检测分析表明突变型活化转录因子NF-κB、激活ISRE的能力都减弱;Real-time PCR分析表明突变型诱导转录IL-6的能力下降。结果表明该点突变影响猪TLR3的信号转导能力。     

玉米赤霉烯酮对Leydig细胞凋亡及caspase-9、caspase-3蛋白表达的影响

以不同浓度的玉米赤霉烯酮（Zearalenone,zEA）对大鼠睾丸间质细胞（Leydig）细胞进行染毒,采用噻唑蓝比色法观察了ZEA对Leydig细胞活力的影响;流式细胞术分析检测了ZEA对细胞的凋亡率、线粒体膜电位变化的影响;Westernblotting等技术检测了Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、PARP蛋白的表达情况。结果显示,ZEA可明显抑制睾丸Leydig细胞的活力（染毒各组与对照组比较P〈0．05）,40mg／L染毒组相对活力为40．67％;与对照组比较,5、10、20mg／LZEA染毒组睾丸Leydig细胞凋亡率均极显著升高（P〈0．05）,呈明显剂量关系;线粒体膜电位变化测定显示,各染毒组与对照组比,线粒体膜电位均下降（P〈0．05）,且有明显的剂量关系;Westernblotting分析显示,与对照组比较,5、10、20mg／LZEA染毒组Bax、caspase-9、caspase-3、PARP蛋白表达均上调,bel-2蛋白表达均下调。结果表明,ZEA能诱导大鼠睾丸间质细胞发生凋亡,Bax、Bcl-2、caspase-9、caspase-3等基因参与ZEA诱导Leydig细胞凋亡的调控。     

牛支原体P48蛋白诱导EBL细胞增殖和凋亡的研究

试验旨在研究牛支原体P48蛋白对胎牛肺（embryonic bovine lung,EBL）细胞增殖和凋亡的影响。收集不同时间段、不同浓度P48蛋白与EBL细胞共孵育的样品,通过MTT法检测细胞增殖率;DAPI染核法观察EBL细胞核形态变化;流式细胞技术检测该蛋白诱导EBL细胞的凋亡率;实时荧光定量PCR检测凋亡标志物的mRNA相对表达变化;Western blotting方法检测Bax和Beclin-1蛋白表达水平。结果显示：当作用时间为72 h,P48蛋白浓度在10 μg/mL时,对EBL细胞增殖有极显著的抑制作用（P<0.01）,在0.1和0.5 μg/mL时对EBL细胞的增殖的抑制作用不显著（P>0.05）;经蛋白诱导12 h细胞核形态未有明显变化,24 h细胞核形态发生皱缩和凝聚,48和72 h细胞核发生碎裂;凋亡标志基因mRNA表达在2和12 h没有明显提高,在24、48、72 h有显著提高,与作用时间呈正相关,同时凋亡相关蛋白Bax和Beclin-1的表达随之显著提高。流式细胞技术结果显示P48蛋白诱导EBL细胞凋亡率为48.44%。综上表明,牛支原体P48重组蛋白能够抑制EBL细胞的增殖,促进细胞凋亡,为进一步揭示牛支原体的致病机制提供参考依据。