BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒

为建立基于无血清悬浮培养细胞生产新城疫病毒(NDV)的工艺,本研究首先筛选了适于NDV增殖的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)单克隆细胞株,并将鸡胚适应的NDV在筛选获得的细胞株(BHK-v002)中传代,获得细胞适应的NDV。进一步采用单因素实验法检测病毒感染复数(MOI)、TPCK-胰酶浓度、细胞培养液的稀释比例等工艺参数对病毒效价的影响。结果显示,NDV在无血清培养的BHK-v002细胞中增殖的最适条件为:当细胞生长至约9.0×10^6个/mL时,以培养液.新鲜培养基为2:1的比例补加新鲜培养基,使细胞密度达6.0×10^6个/m L,按MOI为0.005接种NDV LaSota株,TPCK-胰酶终浓度为5μg/mL。接种病毒后96 h收获病毒液的HA效价为8.5 log2HAU/25μL,单细胞产毒量(Svy)达到1 685.9病毒颗粒/细胞,半数组织细胞感染剂量(TCID50)为7.9 log10TCID50/100μL。本研究确定了NDV LaSota株在BHK-21细胞悬浮培养中的增殖条件,建立了基于BHK-21细胞无血清悬浮培养体系中NDV的生产工艺,该工艺操作简便,易于放大,为当前ND疫苗的鸡胚生产工艺提供了候选替代方案。     

禽副粘病毒Ⅰ型鹅源分离株YG97和鸡源分离株Y98在体外培养细胞中的形态发生

用禽副粘病毒Ⅰ型鹅源分离株YG97和鸡源分离株Y98的鸡胚尿囊液毒感染原代CEF，制作超薄切片，运用透射电镜观察，结果显示，2株病毒引起CEF细胞器肿胀等轻微的超微结构改变，但不引起细胞的皱缩和裂解。结果表明鹅源YG97分离株和鸡源Y98分离株与NDV强毒株F48E8在致细胞病变特性上的差异。透射电镜观察结果还表明：鹅源分离株YG97鸡源分离株Y98在培养细胞上的形态发生与鸡新城疫病毒F48E8强毒株相似，是由细胞核复制的“纤丝样”结构出核孔在细胞浆内发育而成的。     

维药阿魏根多糖体外抗新城疫病毒的作用

用水提醇沉法得到阿魏根总多糖FSPt和4种分级多糖FSP_(30)、FSP_(50)、FSP_(70),FSP_(80)用苯酚-硫酸法及红外光谱对阿魏根多糖进行检测。用MTT法测定各多糖对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度,选择安全浓度范围内5种浓度的各多糖与新城疫病毒(NDV)用3种不同的加药方式(先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加)加入到鸡胚成纤维细胞(CEF)中,用MTT法测定各多糖对NDV感染CEF能力的影响。先加多糖后接病毒组和先接病毒后加多糖组FSP_(30)、FSP_(50)、FSP_(70)和FSPt均能显著抑制NDV感染CEF;多糖与病毒感作后加组FSP_(70)和FSP_(80)有显著抑制NDV感染CEF的作用(P0.05)。结论:新疆阿魏根多糖具有较好的抗NDV作用,其中FSP_(30)和FSP_(50)对病毒的抑制率较高,FSP_(70)在3种加药方式中均表现出显著且稳定的抗NDV作用,综合考虑,FSP_(50)具有很好的研发前景。     

猪伪狂犬状病毒S1株的分离与鉴定

从上海事某猪场发效仔猪体内分离到1株病毒，该毒株能在鸡胚成纤维细胞，RK，Vero,BHK21,ST,PK15细胞上增殖并产生细胞病变，通过蚀斑克隆对其进行纯化，克隆毒株在BHK21细胞上的TCID50为50μL10^-6.68稀释液，该病毒能被伪狂犬病毒（PRV）阳性血清中和，接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应，电镜观察可见直径110－180nm的典型疱疹病毒粒子，用该病毒接种兔仔猪均出现典型的伪狂犬病症状，表明该分离毒株为PRV。     

J亚群禽白血病病毒TCID_(50)不同测定方法的比较

为比较不同方法在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)组织细胞半数感染量(TCID50)上的差异,将ALV-J传染性克隆r NX0101株同一病毒保存液以10倍梯度稀释后按照常规方法分别接种已长满DF-1细胞和鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,维持7 d后取所有细胞培养上清以ALV-p27抗原检测试剂盒检测p27抗原,细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体JE9进行间接免疫荧光(IFA)检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算两种方法在两种细胞上的TCID50。结果显示,ELISA法测定该病毒在DF-1细胞和CEF细胞上的TCID50分别为10-5.4TCID50/0.1 m L和10-4.666TCID50/0.1 m L,而IFA法测定该病毒在DF-1和CEF细胞上的TCID50分别为10-6.333TCID50/0.1 m L和10-5.2TCID50/0.1 m L。结果表明,IFA比ELISA具有更高的灵敏度,并且ALV-J在DF-1细胞上复制能力比CEF更强,在DF-1细胞上测定ALV-J的TCID50更为科学。     

朱砂七提取物体外抑菌和抗病毒活性部位筛选

为筛选朱砂七提取物体外抑制9株临床分离致病菌和抑制新城疫病毒(NDV)的活性部位,采用琼脂扩散和试管稀释法进行体外抑菌试验,MTT法和鸡胚法测定了朱砂七提取物对NDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚内增殖的影响.结果显示,朱砂七乙酸乙酯部位(PCE)对9株临床分离菌的MBC均小于100 g/L;朱砂七氯仿部位(PCC)有一定的抑菌作用;大黄素对沙门菌(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、表皮葡萄球菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌(奶牛)的MBC分别为5,2.5,2.5,2.5,1.25 g/L;PCE进一步分离部位PCEA对沙门菌(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、表皮葡萄球菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌的MBC分别为24,24,12,6,6 g/L.PCC和大黄素对NDV在CEF上增殖的抑制作用不明显;PCE对NDV在CEF上的抑制率为39.12%(P＜0.01),PCEA对NDV在CEF上的抑制率为72.33%(P＜0.01);PCEA对NDV在鸡胚中增殖具有抑制作用,其预防组和药毒混合组与病毒对照组的血凝效价差异显著(P＜0.05),而治疗组与病毒对照组差异不显著.由此可知,朱砂七提取物具有抑制细菌作用,PCE和PCEA对NDV的增殖具有一定的抑制作用.     

传染性法氏囊病疫苗的研究——Ⅰ.传染性法氏囊病病毒2512——弱毒株在鸡胚成纤维细胞培养内的适应

将引自国外的传染性法氏囊病(IBD)—2512鸡胚弱毒成功地适应于鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物。该病毒增殖对生长液要求不苛刻,并能对CEF培养物呈现规律性的稳定的致细胞病变作用(CPE);经反复传代及回归鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)重复性试验,都呈现出IBD病毒规律性变化。经毒价测定、安全实验、效力试验证明,该毒株没有因传代和其他因素而改变其特性,其滴度基本稳定在10~(5.50～5.75)EID50/0.2ml,TCID50/0.1ml为10~(7.83～8.17)。     

禽多元特异性抗体在鸡胚、鸡胚成纤维细胞上对鸡新城疫病毒的抑制性试验研究

利用自行研制的禽多元特异性抗体在鸡胚、鸡胚成纤维(CEF)细胞上对鸡新城疫(ND)病毒的抑制效果进行观察,结果表明:禽多元特异性抗体能有效抑制鸡ND病毒的生长繁殖,且对鸡胚和鸡CEF细胞无任何不良作用,在应用上其预防作用要优于其治疗作用。     

猪伪狂犬病病毒四川株的分离鉴定及UL43基因序列分析

从四川某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒,该毒株能在Vero、MDBK、PK15、ST、MDCK、BHK21、Marc145、鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化,克隆毒株在Vero细胞上为3.0×107TC ID50/0.1mL。该病毒在Vero细胞上连传15代,其TCID50变化很小。病毒对5-溴脱氧尿核苷、氯仿敏感。用该病毒接种家兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状,gE-ELISA检测接种分离毒的仔猪血清,伪狂犬病毒(PRV)抗体阳性。电镜观察可见直径110～140 nm的典型疱疹病毒粒子。上述结果表明分离株为PRV,并命名为SE株。根据已发表的UL43序列设计1对引物,以分离毒株基因组DNA为模板进行PCR扩增,对目的产物进行克隆及测序分析,结果与GenBank收录的其他PRV毒株(Becker、Ea)的UL43核苷酸序列同源性为98.8%,氨基酸同源性分别为95.2%、97.3%。     

江汉平原—规模化猪场暴发伪狂犬病的调查研究(Ⅲ)——猪伪狂犬病毒HS-9304株的克隆纯化及检定

应用细胞培养病毒蚀斑技术,将分离的伪狂犬病毒(PrV)HS-9304株在鸡胚成纤维细胞(CEF)单层培养上覆以营养琼脂培养基,连续挑斑纯化3次,成功地获得了纯化病毒克隆株.对病毒克隆株在传代细胞上复壮增殖后进行毒价测定.接种试验动物人工造病并进行血清中和试验以及外源性污染的检定.该病毒克隆株对BHK-21细胞感染的滴度为10~(8.5)TClD_50,能使小鼠和家兔出现特异性的症状和死亡,病毒对PrV标准阳性血清的中和效价达到1:195.病毒纯净无外源性污染.     

靶向新城疫病毒NP基因的shRNA重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

为验证腺病毒载体在鸡胚成纤维细胞(CEF)及鸡胚中递送小干扰RNA的可行性,本实验利用共转染技术将表达针对新城疫病毒(NDV)NP基因shRNA的重组质粒同源重组到pGSadeno腺病毒载体系统,用重组腺病毒感染CEF和鸡胚,通过红荧光报告基因的表达情况和荧光定量PCR检测NP基因mRNA的表达对其进行鉴定,并通过细胞形态观察、血凝价的测定评价其在CEF和鸡胚上对NDV增殖的影响。实验结果显示重组腺病毒能够感染CEF,感染CEF后6h、9h、12h与对照组比较NP基因mRNA的表达量分别降低了3.2倍,25.6倍,2.57倍,并能够推迟NDV致细胞病变效应,抑制NDV在鸡胚上的增殖,延缓鸡胚的死亡。本实验构建的重组腺病毒能够在CEF和鸡胚上递送特异的shRNA,为在CEF中的RNA干涉研究开辟了新的递送途径。     

中草药在鸡胚成纤维细胞(CEF)上对新城疫病毒的作用研究

分离并培养鸡胚成纤维细胞(CEF),并感染新城疫病毒(NDV),通过观察细胞病变,检测在CEF上,复方中草药对NDV的影响。结果表明,中草药对新城疫病毒的中和、预防、治疗作用的最小抗病毒浓度分别是0.061mg/ml、0.244mg/ml、0.976mg/ml。     

鸡传染性法氏囊病病毒快速适应鸡胚成纤维细胞的研究

将鸡传染性法氏囊病病毒的鸡胚组织毒或法氏囊组织毒直接在鸡胚成纤维细胞(CEF)上盲传3～13代后。能产生特征性细胞病变效应(CPE)。病毒在含65℃灭能30分钟的犊牛血清的细胞生长液制备的CEF上传代,比在含有56℃灭能的犊牛血清的生长液制备的CEF上传代能早3～5代出现CPE,而得到适应;鸡胚高代毒比鸡胚低代毒更易适应CEF;法氏囊组织毒和鸡胚低代毒对适应CEF的进程没有显著差异。     

禽副粘病毒型鹅源分离株YG_(97)和鸡源分离株Y_(98)在体外培养细胞中的形态发生

用禽副粘病毒型鹅源分离株YG97和鸡源分离株Y98的鸡胚尿囊液毒感染原代CEF,制作超薄切片,运用透射电镜观察,结果显示,2株病毒引起CEF细胞器肿胀等轻微的超微结构改变,但不引起细胞的皱缩和裂解。结果表明鹅源YG97分离株和鸡源Y98分离株与NDV强毒株F48E8在致细胞病变特性上的差异。透射电镜观察结果还表明鹅源分离株YG97、鸡源分离株Y98在培养细胞上的形态发生与鸡新城疫病毒F48E8强毒株相似,是由细胞核复制的“纤丝样”结构出核孔在细胞浆内发育而成的。     

禽肺病毒活疫苗的试验和现地应用

美国研究人员用细胞培养物进行63次连续传代(7次鸡胚成纤维细胞和56次Vero细胞)使一株禽肺病毒(APV)分离物(APV/MN/火鸡/1-a/97)减毒并测定了用其作为火鸡活减毒疫苗的效力。在2周龄时用两种剂量减毒病毒(104.5半数组织培养感染剂量(TCID50)/ml和102.5TCID50/ml)给火     

鸡痘病毒FJ01株的分离鉴定

为调查福建规模化养鸡场病鸡的死亡原因,试验以福建省送检的鸡冠及头部皮肤有大量结节状痘痂的病鸡病料为研究对象进行了PCR鉴定。初步鉴定为鸡痘病毒(FWPV)株后,通过接种鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)分离病毒;用原代鸡胚成纤维细胞(CEF)和传代细胞DF-1细胞对病毒进行传代,观察该分离毒株在两种细胞上培养特性的异同;对被感染的CEF进行超薄切片观察病毒的分布及病毒粒子的形态;并针对该分离株的TK基因和FPV175基因序列进行同源性分析。结果显示,接种经抗生素处理后的病料匀浆液上清的CAM出现大面积单个白色隆起的痘斑,匀浆痘斑后同时接种CEF和DF-1细胞,两种细胞均能产生稳定可持续传代的细胞病变,但病变出现的时间及病变程度不同;透射电镜下观察到典型的FWPV粒子密集分布在CEF的胞浆中,清晰可见卵圆形外膜包裹着的两侧凹陷的核心。对其中23个病毒粒子进行统计测得病毒粒子的大小为(258～344) nm×(153～238) nm;针对FWPV TK基因和FPV175基因的PCR检测及测序结果与GenBank收录的FWPV(登录号:NC_002188.1)核苷酸序列同源性分别高达100%和99.8%。以上结果表明该分离毒株为FWPV,命名为FWPV-FJ01,为国内FWPV的防治提供了参考依据。     

人工感染BTV的绵羊血液中进行病毒分离的研究

为了指导蓝舌病(BT)研究中病毒分离工作,确定最佳病毒分离时间,比较鸡胚分离方法和BHK21分离方法的优缺点。本研究通过绵羊人工感染云南优势蓝舌病毒株BTV-1和BTV-16,采集不同时间的血液样品,用鸡胚和BHK21进行病毒分离。结果表明:用鸡胚的分离时间为接种后4~14 d,而BHK21细胞分离时间为2~8 d。本研究结果有助于BTV分离。     

威宁草海黑颈鹤灰鹤新城疫病毒的分离鉴定

本文首次从黑颈鹤和灰鹤自然病例中分离出新城疫病毒(NDV),病毒代号:NDV—C_1(黑颈鹤分离)。NDV—C_2,NDV—C_3(灰鹤分离)。NDV—C_1、C_2、C_3适应鸡胚细胞,并在鸡胚细胞上传代至5代,其毒力致死7日龄雏鸡(非免疫鸡),毒价10~(-7)LD_(50)/ml能致死8日龄鸡胚其毒价为10~(-8)ELD_(50)/0.1m,对鸡胚细胞能产生病变:胞浆膨大,核浓缩并有细胞集落现象。病毒的生物学特性:形态呈球形,有囊膜,纤突和核,病毒粒子大小直径113毫微米,纤毛长约8毫微米。对酸不稳定,核酸型为RNA,能与鸡豚鼠和人的“O”型血球凝集。血清学鉴定结果:新城疫高免血清和康复鹤血清能抑制NDV—C对鸡血球的凝集,禽流感免疫血清则不能抑制,抑制效价分别为128~x和32~x。通过8日龄鸡胚中和试验。鸡新城疫免疫血清中和NDV—C,其中和指数为1862,用50％终点中和计算法,中和指数>50。用新城疫Ⅰ系苗免病40日龄鸡测对NDV—C和保护率,结果对NDV—C_1 9/10保护,对NDV—C_2~10 O/10,对NDV—C_3 10/10保护。鉴定结果:NDV—C_1、C_2、C_3均属副粘病毒属中的新城疫病毒。     

鸡新城疫病毒Ⅰ系在不同细胞上增殖特性的研究

为了在疫苗生产过程中实现应用传代细胞系大规模增殖培养鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV),试验将NDVⅠ系分别接种至BHK-21、Vero与DF-1细胞系中,并对F1～F3代不同细胞培养物的凝集价、细胞半数感染量(TCID_(50))与鸡胚半数感染量(EID_(50))进行测定,研究NDVⅠ系在BHK-21、Vero与DF-1细胞上的增殖特性,并确定培养NDVⅠ系的最佳细胞系。结果表明:NDVⅠ系在BHK-21、Vero与DF-1细胞中均可增殖,并产生明显的细胞病变;F1～F3代细胞培养物随着传代次数的增加,凝集价(DF-1细胞除外)、TCID_(50)与ELD_(50)下降;用BHK-21细胞培养的病毒毒力显著高于另两种细胞培养物。说明在三种传代细胞系中,BHK-21细胞较DF-1与Vero细胞更适合于NDVⅠ系的生长。     

鸡新城疫CS_2株与4株疫苗毒株有关性能的比较

对鸡新城疫病毒 (NDV)中等毒力毒株 CS2 株、ND 系、Rokin、Komerov和低毒力La Sota株病毒的脑内致病指数 (ICPI)、鸡胚的半数感染量 (EID50 )等指标进行了测定 ,结果是 ICPI分别为 1 .2 7～ 1 .52、1 .66～ 1 .70、1 .46、1 .43和 0 .2 9～ 0 .5;EID50 分别为 1 0 7.5、1 0 7.5、≥ 1 0 8.5、1 0 7.9和≥ 1 0 8.5/0 .1 ml。用 1 0倍剂量的 CS2 株病毒注射 1月龄和 1 .5月龄 SPF雏鸡 ,均安全无不良反应。测定 CS2 株病毒保存期 ,结果在 - 2 0℃保存 6年的鸡胚 2代 (E2 )、鸡胚 6代 (E6)、鸡胚 1 0代 (E10 )毒的 EID50 均≥ 1 0 7.5/0 .1 ml。ND CS2 株病毒的各项指标均在中等毒力范围内 ,对鸡胚的半数感染量仍保持原毒 ( 系 )的特性 ,ICPI比原毒有所下降。与 NDV Rokin、Komerov毒株相比 ,0 .1 ml鸡胚液中病毒含量较低 ,对鸡胚的毒力较强 ,ICPI没有明显差别