牛传染性鼻气管炎病毒抗体胶体金检测试纸条的制备

采用SF 9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原,经纯化鉴定后将gD蛋白用胶体金标记作为示踪抗原,未标记的gD抗原作为捕获抗原,并以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体,建立了牛传染性鼻气管炎病毒双抗原夹心法胶体金检测试纸条。试验结果表明,该试纸条检测灵敏度高,特异性良好,与牛口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒等阳性血清无交叉反应。使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒抗体ELISA检测试剂盒同时检测112份牛血清,阳性符合率为93.5%,阴性符合率为96.0%,总符合率为94.6%。说明该试纸条可以应用于临床牛传染性鼻气管炎病毒抗体的诊断和检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒DQ株gD基因表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用

以原核表达的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gD蛋白作为包被抗原,建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法.构建pET30a-gD重组质粒,在大肠杆菌中表达IBRV重组gD蛋白,Western-blot检测该重组蛋白具有良好的免疫活性.通过方阵试验确定了抗原的最适包被浓度为2.5 μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:200,酶标二抗最佳稀释倍数为1:5 000,与病毒中和试验,全病毒ELISA方法的检测结果符合率分别为87.5%、92.5%.用该法对黑龙江部分地区采集到的863份牛血清样品进行检测,结果阳性率为82.27%.本试验建立的间接ELISA方法可用于IBR的检测和流行病学调查.     

牛病毒性腹泻病毒抗体胶体金检测试纸条的制备

采用sf9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达牛病毒性腹泻病毒P80蛋白抗原,经纯化鉴定后将P80蛋白用胶体金标记作为示踪抗原,未标记的P80抗原作为捕获抗原,并以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体,建立了牛病毒性腹泻病毒抗体快速诊断试纸条。试验结果表明,该试纸条检测灵敏度高,特异性良好,与牛口蹄疫病毒、牛传染性鼻气管炎病毒无交叉反应。使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒同时检测80头份牛血清,阳性结果符合率为86.7%,阴性结果符合率为100%,总符合率为95%。该试纸条可用于临床牛病毒性腹泻病毒抗体的诊断和检测。     

IBRV gD蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

利用生物学软件分析牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白的抗原决定簇,发现相应的核酸序列,设计特异性引物用PCR扩增IBRV gD基因片段并克隆到原核表达载体pET-32a中,通过双酶切鉴定正确和测序正确后进行诱导表达。利用间接ELISA方法和Western blot鉴定gD重组蛋白的免疫原性和反应原性。最后将gD重组蛋白用作包被抗原,并通过优化相应的反应条件建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法。结果显示,表达的gD重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,间接ELISA阴阳性临界值为:D_(450 nm)值=0.23。重组抗原gD与口蹄疫、牛病毒性腹泻、赤羽病、副结核病、布鲁菌病、结核病等阳性血清无交叉反应,具有比较好的特异性。组内和组间变异系数均小于5%,重复性较好。建立的ELISA方法结果显示,当测试相同的200个临床血清样本时,与IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒gB X3抗体检测试剂盒相比,两者符合率为96%。本试验为IBRV抗体间接ELISA检测试剂盒的开发奠定了基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白原核表达及间接ELISA检测方法研究

本研究以牛传染性鼻气管炎gE基因的原核表达产物为抗原建立检测IBRV抗体间接ELISA检测方法。通过DANStar比对分析牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白序列,通过亲和层析对重组表达产物进行纯化,经Western blot检测证明重组表达产物能被IBRV标准性鼻气管炎gE蛋白长度为500 bp的特异性肽序列,随后构建了pCold-TF-gE原核表达体系,并用Ni-IDA进行纯化。以纯化鉴定后的表达产物为抗原(1 μg/mL)包被酶标板制备多克隆抗体血清,并建立检测牛传染性鼻气管炎血清抗体间接gE-ELISA方法。结果显示:阳性OD₄₅₀值为0.369,组内组间重复性小于5%,敏感性强,与口蹄疫等阳性血清均无交叉反应且特异性达95%。利用建立的gE-ELISA方法,同时和IDEXX(IBR)抗体检测试剂盒对200份临床阳性血清进行检测比较,符合率均达到95%。该方法特异敏感高效,可用于牛传染性鼻气管炎血清抗体的检测。     

IBRV重组gD蛋白的真核表达与间接ELISA检测方法的建立

通过优化牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）gD基因序列为Sf9细胞偏好密码子,转座形成穿梭载体,将质粒瞬时转染Sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统表达纯化重组IBRV gD蛋白;以制备的重组IBRV gD蛋白为包被抗原,建立检测IBRV血清中和抗体的间接ELISA方法,并通过比对检测已知血清中和抗体效价的牛血清,验证所建立的间接ELISA方法的敏感性、特异性与重复性等指标。结果显示：本研究建立的间接ELISA方法对相关的牛病毒血清抗体无交叉反应,敏感性可达1:512,组内和组间变异系数均低于10%;使用建立的间接ELISA检测方法结合血清中和试验,对480份临床血清样品进行检测,发现两者敏感性符合率为98.18%,特异性符合率为93.33%,总符合率为96.67%。结果表明,本研究建立的检测IBRV血清中和抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可开发为临床适应的检测试剂盒。     

牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA方法的建立及应用

用大肠杆菌表达的牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）重组gD蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法。交叉反应试验表明,该重组抗原与其它常见的5种牛病阳性血清不发生交叉反应;阻断反应试验表明,IBRV病毒悬液能在很大程度上阻断重组抗原与阳性血清的反应,而对阴性血清没有明显影响。在重复性试验中,批内重复的变异系数小于5%,批间重复的变异系数小于15%。与中和试验相比较,符合率、敏感性和特异性分别为84.1%、85.0%和83.4%。应用该诊断方法和本实验室已建立的以IBRV全病毒作为包被抗原的ELISA诊断方法,同时检测了采集于国内11个省份的2012份血清样本,IBRVgD-ELISA检测的平均阳性率为46.0%（926/2012）,而且相对于IBRV全病毒ELISA诊断方法的符合率、敏感性和特异性分别为91.9%、94.2%和90.2%。本研究所建立的IBRVgD-ELISA具有良好的敏感性和特异性,为国内IBR流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

布鲁氏菌抗体时间分辨荧光检测方法的建立

用布鲁氏菌的Bp26蛋白包被免疫层析试纸条的检测线,以稀土荧光纳米颗粒标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)作为信号报告基团,建立了检测布鲁氏菌抗体的时间分辨荧光检测方法。用制备的稀土荧光试纸条检测715份牛血清,与虎红平板凝集试验结果的符合率为92%,且与牛巴贝斯虫阳性血清、牛结核菌阳性血清、牛副结核杆菌阳性血清、口蹄疫阳性血清均无交叉反应,检测灵敏性好于胶体金试纸条。     

牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用

为了建立一种快速检测牛分支杆菌抗体的新方法用于诊断牛结核病,利用胶体金免疫层析技术原理,用原核诱导表达的牛分支杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条.结果表明,粒径为40 nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.0,MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5 μg,MPB70抗原的最适包被浓度为3.0 mg/mL,抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5 mg/mL,交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性.比较试验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条.在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较.本试纸条与牛分支杆菌分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%.快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核病根除计划中具有良好的应用前景.     

牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和初步运用

目的:建立一种快速检测牛结核抗体的新方法,用以诊断牛结核病。方法:利用胶体金免疫层析技术原理,用大肠杆菌表达的牛分枝杆菌重组抗原MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条。结果:粒径为40nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高;胶体金最佳标记pH值为6.0;MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5μg;MPB70抗原的最适包被浓度为3.0mg/mL;抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5mg/mL;交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性。比较实验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条。在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较。本试纸条与牛分枝杆茵分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%。结论:快速检测牛结核抗体的胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核根除计划中具有良好的应用前景。     

猪肺炎支原体抗体胶体金免疫层析检测方法的建立

旨在建立猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)抗体胶体金免疫层析检测方法,从而快速地对Mhp的感染和免疫情况进行监测,预防和控制猪支原体肺炎传播。通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,确定Mhp特异性抗原P46蛋白的最适标记pH和标记浓度并进行标记,作为金标液。将P46蛋白包被检测线T线,抗P46蛋白单抗包被质控线C线,组装检测试纸条。经优化,建立可同时用于Mhp血清抗体和黏膜抗体检测的胶体金免疫层析检测方法。利用该检测方法对76份临床血清样品和40份临床鼻拭子样品进行检测,并与ELISA检测结果进行比较。用该试纸条检测血清样品时,灵敏性、特异性、重复性较好,与商品化Mhp ELISA抗体检测试剂盒符合率为96.1%;该方法检测呼吸道鼻拭子样品时,存在微弱的非特异性反应,检测结果与本实验室建立的sIgAELISA检测方法符合率为87.5%。本研究成功建立了Mhp抗体胶体金免疫层析检测方法,整个过程只需10 min。检测血清样品具有较好的特异性和灵敏性,检测鼻拭子样品时特异性还有待提高。     

牛布鲁氏菌抗体荧光快速检测试纸卡的研制

为研制一种快速检测牛布鲁氏菌抗体的便捷试纸卡,采用间接荧光免疫层析技术,以荧光微球为标记物,与兔抗牛IgG偶联,以布鲁氏菌脂多糖（LPS）抗原包被硝酸纤维素膜,通过反应条件优化,研制牛布鲁氏菌抗体荧光微球快速检测试纸卡。结果显示：该试纸卡灵敏度可达0.8 IU/mL,与牛口蹄疫病毒O型、牛口蹄疫病毒A型、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的抗体阳性血清均无交叉反应;对469份临床牛血清进行检测,同时与荧光偏振方法进行比较,发现两种方法的符合率为100%。结果表明,本次研制的牛布鲁氏菌抗体荧光微球检测试纸卡灵敏度高,特异性好,适用于临床样品的快速检测。本试纸卡的成功研制为牛布鲁氏菌病免疫效果评估和准确诊断提供了一种简便的血清学诊断方法。     

牛赤羽病胶体金抗体检测试纸条的研制

研究旨在制备一种现场快速筛查牛赤羽病的免疫层析试纸条。通过胶体金标记赤羽病病毒N蛋白,将兔抗牛IgG和兔抗N蛋白多克隆抗体分别喷涂于NC膜上作为检测线（T）和质控线（C）。结果显示,牛赤羽病毒阳性抗体血清稀释度为1∶512时,检测线仍显色;且与牛病毒性腹泻病毒、牛结核病、布鲁氏菌病、牛巴氏杆菌病、地方流行性牛白血病毒和蓝舌病毒的阳性血清均无交叉反应;使用试纸条和商品化ELISA试剂盒同时检测40份田间牛血清样品的结果符合率为92.6%。研究表明,试纸条适用于基层养殖户对牛赤羽病的筛查。     

鱼类病毒性出血性败血症病毒诊断胶体金免疫层析方法的建立

为建立一种快速检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以标记纯化的VHSV G蛋白单克隆抗体(MAb)10A7为捕捉抗体,将纯化的抗VHSV N蛋白的MAb 10EN单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带,经试验条件优化,组装形成胶体金免疫层析试纸条。用本试验研制的胶体金试纸条检测VHSV感染的CHSE细胞培养物。结果显示:在检测线和质控线均呈现红色条带,而健康的CHSE细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的病毒量最低限为10~(4.0) TCID_(50);随机挑取3个不同批次的试纸条,对阳性样品和阴性样品进行重复试验,未发现差异。特异性试验表明,该试纸条与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、牙鲆弹状病毒(HRV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)无交叉反应。将同一批次的试纸条在4℃条件下保存不同时间后进行检测,发现保存6个月的试纸条仍具有良好的稳定性。本试验研发的胶体金诊断试纸条具有良好的特异性、灵敏性和重复性,在快速辅助检测方面具有推广应用价值。     

牛传染性鼻气管炎检测方法的研究进展

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)是引起牛传染性鼻气管炎的病原。文中介绍了牛传染性鼻气管炎的各种检测方法的研究进展,包括病理组织学诊断、病毒的分离鉴定、免疫学检测和核酸分子检测,为牛传染性鼻气管炎的检测提供了有价值的参考。     

新疆阿克苏地区牛传染性鼻气管炎病毒与牛副流感病毒3型感染的检测

为调查阿克苏地区是否存在牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)与牛副流感病毒3型(BPIV-3)的感染,从阿克苏两个规模化奶牛场采集1月龄以内可疑发病犊牛鼻液样品18份,采用双抗体夹心ELISA方法检测两种病毒的抗原,PCR方法检测牛传染性鼻气管炎病毒gD基因,RT-PCR方法检测牛副流感病毒3型的gM基因。结果表明,ELISA方法检测IBRV和BPIV-3的感染率分别为22.22%和0%;PCR方法检测IBRV的感染率为72.22%;RT-PCR检测BPIV-3的感染率为44.44%;同时患有两种病毒的检出率为22.22%。说明在阿克苏地区存在IBRV与BPIV-3的感染,且存在两种病毒的双重感染。     

光生物素核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究

用光生物素标记牛传染鼻气管炎病毒(IBRV)基因的9.6kb片段制成探针,能检出10pg的IBRV—DNA,1个TCID_(50)量的病毒和1个TCID_(50)掺毒量的精液,与其它病毒无交叉反应。检测人工感染牛的鼻、眼拭子和病毒分离符合率为84.4％,检测感染细胞与细胞病变符合率达81.7%,两项综合符合率为82.5%,以病毒分离为标准,核酸探针检测的鼻眼拭子特异性为90.9%,灵敏度为71.4%。鼻眼拭子经一代细胞培养增毒后再用核酸探针检测,与病毒分离的符合率达93.8%,特异性和灵敏度均达92.9%。 牛传染性鼻气管炎是由IBRV引起的牛呼吸道炎症、生殖道感染、结膜炎、脑膜脑炎等症状的疾病。此病的诊断通常采用中和试验、ELISA等方法检查感染动物的血清抗体以及病毒分离检测病原。只要病料新鲜,分离病毒并不困难,但从牛精液中分离IBRV,由于精液对细胞有毒性影响,有时不一定能成功。用核酸探针检测病毒基因是一种快速、灵敏、简便的方法,我们采用光生物素标记IBRV基因的9.6kb片段作探针,对IBRV掺毒精液及人工感染牛的鼻、眼拭子进行检测,并与病毒分离进行比较,结果表明核酸探针具有较高的特异性和灵敏度,与病毒分离符合率在8(?)%以上,可与病毒分离互相补充作为病原检测的一种手段。     

检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层析方法的建立

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)野毒的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗CSFVE2蛋白的单克隆抗体(MAb)6E10作为捕捉抗体,将纯化的抗CSFVE2蛋白的MAbHQ06和兔抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,优化反应条件,组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条用于检测CSFV野毒感染的PK-15细胞培养物,在检测线和质控线处均呈现红色条带,健康PK-15细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的最低限为103.5 TCID50;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;该试纸条不与猪瘟兔化弱毒(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)反应。所制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因截短表达及其抗血清制备

gD糖蛋白是IBRV感染细胞的主要分子,在病毒吸附和侵入宿主细胞中发挥着重要作用。利用IBRV基因组DNA为模板,经生物学软件DNAstar分析主要抗原区,PCR扩增gD基因786bp片段,定向连接到pET32a(+)表达载体中,筛选阳性克隆转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达部分可溶的重组蛋白。Ni-NTA非变性纯化系统纯化蛋白,纯化的蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,利用间接ELISA法检测抗血清效价为1∶6400;同时以该血清进行血清中和病毒实验,中和指数为1∶640,显示该抗血清具有良好的抗病毒能力,为进一步开发牛传染性鼻气管炎(IBR)的诊断检测试剂和疫苗奠定了重要基础。     

IBRV特异性噬菌体单域抗体库的构建、筛选及鉴定

为了开发有效的用于治疗和诊断牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis,IBR)的抗体,试验用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)免疫双峰驼,构建IBRV特异性噬菌体单域抗体库,并以IBRV gD蛋白为筛选抗原,对其进行筛选,对筛选得到的单域抗体进行诱导表达、纯化及鉴定。结果表明:构建得到的IBRV特异性噬菌体单域抗体库的库容为7×10~7;经3轮富集和筛选,phage-ELISA筛选出14个与gD蛋白结合的阳性克隆,并成功对阳性值较高的重组单域抗体IB68进行表达和纯化;经ELISA和Western-blot鉴定,重组单域抗体IB68可与gD蛋白产生抗原抗体结合反应,具有较高的亲和力。说明制备的IBRV特异性噬菌体单域抗体库具有较高的库容和多样性,且筛选得到的单域抗体具有较高的抗原抗体结合活性和免疫学反应性。