猪MSTN基因双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素（Myostatin,MSTN）基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。以pUC57载体为骨架载体,在其多克隆位点连接一段包括Frt序列在内的酶切位点的多克隆位点序列,在2个Frt序列之间连接正筛选标记嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因,在Frt序列两侧分别连接5.7和1.9 kb的MSTN基因同源长、短臂;在同源短臂后连接负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,将目的片段与载体定向连接克隆。用脂质体法将打靶载体转染猪肾细胞（PK15细胞）,用嘌呤霉素和丙氧鸟苷进行正负筛选,验证正负筛选标记基因的功能。【结果】成功克隆了猪MSTN基因同源长、短臂及正筛选嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体,打靶载体长14 kb。在打靶载体转染的PK15细胞中,正负筛选标记基因均有生物学活性。【结论】成功构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体功能研究进展

正猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以妊娠母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸道症状为主要特征的传染病,该病严重危害世界养猪业~[1]。PRRSV属套式病毒目,动脉炎病毒科,动脉炎病毒属,为单股、正链、不分节段的RNA病毒。病毒基因组长度     

禽脑脊髓炎病毒感染雏鸡的病理组织学观察

禽脑脊髓炎(AE)是由禽脑脊髓炎病毒(AEV)以主要侵害幼鸡中枢神经系统引起非化脓性脑脊髓炎为主要病理特征的急性、高度接触性传染病[1].成年母鸡主要表现为产蛋量有不同程度的下降,雏鸡死亡率可高达57%[2-3].部分存活鸡一侧或两侧眼球的晶状体混浊或呈浅蓝色,严重者失明[4].     

PRRSV细胞受体CD163 SRCR5-SRCR6多克隆抗体的制备

【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA,通过RT-PCR方法获得CD163SRCR5-SRCR6(第1 417~2 136bp,共720个bp)基因,将其克隆到pET-28a(+)载体上,构建重组表达载体pET-28a(+)-CD163,经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌,在BL21(DE3)中诱导重组目的蛋白表达,然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价,并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞的活性。【结果】克隆了720bp的CD163SRCR5-SRCR6基因,成功构建了pET-28a(+)-CD163重组表达载体;SDS-PAGE结果表明,CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白被成功诱导并以包涵体形式表达;Western blot结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性,间接ELISA方法测得免疫Balb/c小鼠制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体效价可达105;IFA试验结果显示,制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体可与Marc-145细胞结合,且在1∶20、1∶40倍稀释时,能部分阻断高致病性PRRSV SD16毒株感染Marc145细胞。【结论】用大肠杆菌原核表达系统成功诱导表达了CD163SRCR5-SRCR 6重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得了高效价多克隆抗体,其可以结合细胞并阻断PRRSV感染细胞。     

检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层析方法的建立

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)野毒的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗CSFVE2蛋白的单克隆抗体(MAb)6E10作为捕捉抗体,将纯化的抗CSFVE2蛋白的MAbHQ06和兔抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,优化反应条件,组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条用于检测CSFV野毒感染的PK-15细胞培养物,在检测线和质控线处均呈现红色条带,健康PK-15细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的最低限为103.5 TCID50;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;该试纸条不与猪瘟兔化弱毒(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)反应。所制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。     

适宜籽粒机收玉米杂交组合的鉴定和筛选研究

利用57个玉米杂交组合为材料,分析不同组合的收获时籽粒含水量、单产、果穗秃尖长和异常果穗比例性状,以筛选高产、收获时籽粒含水量低且果穗性状表现优良的玉米杂交组合.结果表明,57个玉米杂交组合收获时籽粒含水量差异显著,最高为36.23％,最低为20.80％.单产性状分析表明,比对照郑单958增产5％以上的组合有3个,比对照郑单958增产5％以内的组合有4个.果穗秃尖长和异常果穗比例分析表明,果穗秃尖长最大为3.13 cm,最小为0.00 cm,差异显著;异常果穗比例最高为21％,最低为1.95％,差异显著.综合收获时籽粒含水量、单产、果穗秃尖长和异常穗比例4个性状分析,杂交组合JK 609、JK 610、JK 618、JK 638收获时籽粒含水量低且丰产性突出,同时果穗秃尖短、异常果穗比例低,是优良杂交组合,可重点研究利用.     

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A羧基端蛋白的真核表达及在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞中的作用

前期研究结果证明抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的抗独特型抗体特异性结合Marc-145细胞上的非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(Nonmuscle myosin heavy chainⅡ-A,NMHCⅡ-A)蛋白,其结合位点位于NMHCⅡ-A的羧基端。本研究通过真核表达NMHCⅡ-A的羧基端(PRA)蛋白,验证其对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达PRA蛋白。Western blot和间接免疫荧光鉴定PRA蛋白的表达及其与Marc-145细胞的结合。通过病毒中和试验、荧光聚焦中和试验和荧光定量PCR检测PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。Western blot和间接免疫荧光结果表明,PRA蛋白在真核细胞中得到成功表达,其最高表达量为接种1个MOI杆状病毒后96h时。PRA蛋白特异性结合Marc-145细胞,使PRRSV感染Marc-145细胞延迟24h并且感染效率降低60%。真核表达的NMHCⅡ-A羧基端蛋白能特异性结合Marc-145细胞并有效降低PRRSV的感染。这些结果为进一步阐明NMHCⅡ-A在PRRSV感染细胞过程中的作用提供了新的依据。     

不同生态区多环境下优良玉米自交系的筛选研究

【目的】利用不同生态区的多种气候和土壤环境以及自然病害压力筛选综合性状优良的玉米自交系,为选育广适型优良自交系探明一种可行的方法。【方法】以黄改群和改良Reid群的50份玉米自交系为材料,进行不同生态区多环境的种植鉴定,以开花期、株型、抗病和产量性状分析为基础,筛选优良自交系。【结果】结果表明,同一个自交系在不同生态区多环境下开花期、株型、抗病及产量性状存在显著差异,是筛选综合性状优良自交系的基础。通过开花期、株型、抗病及产量性状的综合分析,筛选出综合表现突出的自交系京457和京917;自交系京931株型、抗病、产量及其稳定性表现突出;自交系京332和京337开花期、株型和抗病性表现突出。【结论】不同生态区多环境下鉴定是筛选优良玉米自交系的有效手段。     

雄性不育制种京科968的遗传背景及其表型分析

利用40对SSR核心引物和MaizeSNP3072芯片对京科968雄性不育及常规制种的母本和杂交种进行遗传背景分析发现,雄性不育制种母本不育系S京724与常规制种母本京724之间、雄性不育制种京科968(S京科968)与常规制种京科968(N京科968)之间均未检测到差异位点。结果表明,S京724与京724在株高等农艺性状、单穗粒重等产量性状上的表现均无显著性差异。经花粉I_2-KI染色鉴定,S京科968花粉表现约50%可染、50%败育,与S型细胞质的恢复型F_1代植株花粉育性吻合。多点鉴定结果表明,S京科968与N京科968在株高、穗位高、雄穗分枝数、雄穗主轴长等农艺性状和穗长、穗粗、穗行数、行粒数、单穗粒重、容重等产量性状上的表现均无显著性差异。结果证明,利用S型细胞质雄性不育系进行京科968三系配套杂交种制种是切实可行的。