鹅FSH基因原核表达

促卵泡激素（follicle stimulating hormone,FSH）作为调节家禽卵泡发育重要的候选基因,但FSH在生物体内的半衰期非常短,本试验将具有延长基因半衰期作用的CTP序列添加到鹅FSH基因各亚基的C末端进行基因融合,以期获得pET32a-FSHα-CTP、pET32a-FSHβ-CTP和pET32a-FSHβ-CTP-α重组蛋白。设计去除目的基因信号肽和含有酶切位点的特异性引物,经融合PCR扩增获得了目的基因FSHα-CTP、FSHβ-CTP和FSHβ-CTP-α,通过构建原核表达载体pET32a-FSHα-CTP、pET32a-FSHβ-CTP和pET32a-FSHβ-CTP-α,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,蛋白纯化。结果显示,3个融合蛋白FSHα-CTP、FSHβ-CTP和FSHβ-CTP-α的IPTG最佳诱导时间分别为4、5和5h,最佳诱导浓度分别为0.2、0.8和1.5mmol/L,且都是以包涵体形式存在,相对分子质量分别为32 000、35 000和46 000,与预期大小一致。结果表明,本试验成功构建了鹅pET-32a-FSHα-CTP、pET-32a-FSHβ-CTP和pET-32a-FSHβ-CTP-α的原核表达载体,并对它们的重组蛋白进行了纯化,为开展鹅FSH的基因免疫研究和鹅rFSH生物制剂研发奠定基础。     

猪α干扰素基因在pET32a表达载体中的表达和鉴定

利用PCR技术从猪瘟免疫猪血中提取基因组,并从中扩增出约500 bp的基因片段;将此基因片段克隆于大肠杆菌pMD18-T载体,经PCR、测序鉴定后,将其片段克隆于pET32a(+)载体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明,猪α干扰素在pET32a原核表达载体中成功地获得了分泌表达,且表达蛋白在PK-15细胞上表现出较强的抗病毒活性,这为进一步研究猪α干扰素的功能和开发奠定了基础.     

猪β-防御素-2基因在大肠杆菌中的融合表达及抑菌活性检测

将猪β-防御素-2基因(pBD-2)片段正确连接到pET32a载体上,从而得到稳定表达pBD-2的大肠杆菌表达株。根据已报道的pBD-2基因序列,按大肠杆菌密码子优化原则合成了5条pBD-2基因片段,通过重叠延伸PCR(SOE PCR)方法将这5段延伸成完整的pBD-2基因序列,将该基因定向插入原核表达质粒pET32a的多克隆位点上,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出TrxA-pBD2融合蛋白。结果显示,表达的融合蛋白用肠激酶切掉TrxA后做琼脂孔穴扩散法检测,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,表明试验获得表达pBD-2的大肠杆菌菌株。     

猪IL-18基因原核表达载体的构建及表达

以含新兴猪IL-18基因的真核质粒pcDNA3.1-pIL18为模板,扩增出新兴猪IL-18基因,将其定向克隆至原核表达载体pET32c和pET41c的SacⅠ和KpnⅠ位点,构建了原核表达载体pET32c-pIL18和pET41c-pIL18。经酶切和PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性新兴猪IL-18基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)细胞,筛选的阳性菌落经SDS-PAGE分析及Western-blotting分析,表明成功构建了表达重组猪IL-18的大肠埃希菌基因工程菌株。蛋白的可溶性分析表明,重组蛋白呈不可溶表达,在菌体内以不溶性的包涵体形式存在。     

山羊痘病毒p32基因的克隆、表达及单克隆抗体制备

本研究旨在表达山羊痘病毒p32蛋白、制备p32蛋白单克隆抗体。通过PCR克隆p32基因,连接到pMD18-T并测序;酶切、连接后将p32基因克隆到pET28a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,在IPTG诱导下成功表达p32蛋白;利用亲和层析法纯化p32蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后制备p32蛋白单克隆抗体,获得22株识别重组蛋白的单抗,通过间接免疫荧光鉴定,其中3株能识别病毒的p32蛋白。山羊痘病毒p32蛋白的表达和单克隆抗体的制备为山羊痘病毒抗原、抗体检测提供了生物材料。     

人补体C1INH基因的原核表达及其抗血清的制备

 采用PCR技术获得人补体C1INH基因全长,以其为模板扩增出抗原表位基因片段命名为C1,然后将C1片段重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌;IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21培养物,纯化蛋白后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析表明,pET32a-C1融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6 400;Western-blot检测显示,抗血清可与原核表达的C1INH蛋白进行特异性结合,为进一步检测真核表达蛋白及研究rhC1INH的功能活性,并为C1INH的临床检测奠定基础。     

梅花鹿鹿茸表皮生长因子基因原核表达载体的构建及鉴定

通过T-A克隆技术,成功地构建了克隆载体pMD-18T-EGF,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切克隆质粒pMD-18T-EGF后,回收EGF基因,并将此基因定向克隆至相同双酶切回收后的pET32a原核表达载体中,获得重组质粒pET32a-EGF。经限制性内切酶分析和PCR鉴定,结果表明:成功地构建了原核重组质粒。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒pT-VP4和pT-VP7中护增VP4、VP7基因，连接至pGEM-5zf( )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒pET-28a( )，连接、转化受体菌，经PCR、酶切和序列分析证明，连接向位和阅读框架是正确的，从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体pET28a-VP4、pET28a-VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下，用SDS-PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明，表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，蛋白的分子量分别为37.69和36.20ku，表达量占菌体总蛋白的比例分别为17.1%和14.4%。     

新城疫病毒HN蛋白抗原表位分析及结构域基因原核表达

以本实验室构建的含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组质粒为模板，设计引物通过PCR和重叠-延伸PCR扩增，获得HNa、HNb和HNa-L-b三种抗原结构域基因片段，BamHⅠ／HindⅢ双酶切定向克隆到原核表达载体pET32c，获得重组质粒分别命名为pET32c—HNa、pET32c-HNb和pET32c．HNa—L—b。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，筛选出阳性克隆，诱导表达并取产物进行分析。结果表明，HNa、HNb、HNa-L-b结构域基因片段均获得了融合表达。Western-blotting分析证实表达产物HNa和HNb与NDV阳性血清具有免疫反应性。本试验结果为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白在细胞融合中的相互作用奠定了基础。     

产单核细胞李斯特菌溶血素基因的克隆及原核表达

利用PCR方法扩增产单核细胞李斯特菌（LM）的溶血素基因hlyA,获得一条大小约为1600bp的目的片段,将其与pMD18-T载体连接,经酶切、PCR鉴定,命名为pMD18-T—hlyA。测序结果显示所扩增的hlyA基因与GenBank中发表的hlyA的序列同源性为99％。利用含有BamHⅠ／XhoⅠ酶切位点引物B从pMD18-T—hlyA扩增不含信号肽序列的目的片段B,获得了大小约为1500bp的基因片段,该片段与pET32a表达载体经BamHⅠ／XhoⅠ处理后进行连接,转化BL21受菌体。通过酶切、PCR鉴定及序列测定后获得阳性pET32a-hlyA表达重组质粒,将重组菌用终浓度为0．1mmol／L的IPTG进行诱导表达,结果表明重组菌在诱导2h～3h表达量最高,融合蛋白约占菌体的40％,分子量大小约为80ku;利用LM的阳性血清进行Western blot分析,证实该融合蛋白可以被LM阳性血清所识别,为今后研制针对该蛋白的单克隆抗体和建立间接ELISA诊断方法提供了条件。     

鸭源鸡杆菌flfA基因的克隆表达及抗原性分析

用PCR方法从鸭源鸡杆菌中国分离株PDS-RZ-1-SLG中扩增flfA基因,并运用生物信息学软件分析鸭源鸡杆菌菌毛蛋白FlfA的二级结构、表面可及性与B细胞优势表位簇;将目的基因插入原核表达载体Pet28a(+),经PCR、酶切及测序鉴定成功构建重组表达质粒pET28a(+)-FlfA,然后转化到大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组质粒表达;SDS-PAGE和Western blot鉴定FlfA的表达及抗原性。结果显示:成功获得与预期大小一致的573bp的flfA基因;FlfA蛋白结构分析显示其二级结构以无规则卷曲为主,表面存在很多抗原表位;PCR及酶切等鉴定表明重组表达质粒pET28a(+)-FlfA构建成功。SDS-PAGE分析显示,经IPTG诱导表达获得相对分子质量约20 000的重组蛋白;Western blot分析结果显示重组菌毛蛋白能被兔抗rFlfA多抗血清和鸡抗鸭源鸡杆菌血清识别,抗原性良好;而且,rFlfA多抗血清与菌毛蛋白具有良好反应性。     

犬瘟热病毒贵州株融合蛋白基因原核表达质粒的构建

为了研究犬瘟热病毒贵州株(CDV-GZ1)完整融合蛋白(F),试验采用PCR方法以pMD18-F质粒为模板,利用特异性引物扩增获得大小为1 989 bp的目的 DNA,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32a(+)-F。结果表明:目的基因插入位置和阅读框均正确,说明F基因原核表达质粒构建成功;质粒pET32a(+)-F在BL21(DE3)中经诱导表达未获目的蛋白,说明CDV融合蛋白可能不适合在该表达系统中进行完整蛋白的表达。     

鸡去泛素化相关因子1基因原核表达载体的构建及表达

构建鸡去泛素化相关因子1(Chicken ubiquitin-related factor 1,chUAF1)的原核表达载体,并对表达产物进行鉴定.将提取的鸡法氏囊cDNA根据哺乳动物基因组的特性5'-端GC含量高3'-端GC含量低的特点设计2对引物,PCR获取2段基因片段.将两者用搭桥部分的酶切位点进行酶切,胶回收,连接成chUAF1基因全长,再将基因克隆入pMD18-T载体,酶切鉴定后,将chUAF1基因亚克隆到pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-UAF1.转化BL21(DE3)大肠杆菌中,IPTG诱导表达并鉴定.结果显示,所构建的chUAF1基因表达载体pET28a-chUAF1经PCR及DNA测序结果表明构建正确,SDS-PAGE鉴定在预期位置出现阳性条带.结果表明,已成功构建了pET28a-chUAF1原核表达载体,为下一步试验提供了依据.     

禽呼肠孤病毒σC基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术设计扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株的σC基因,将扩增基因克隆至pMD-19T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆的基因片段为ARV σC基因.将该基因重组至pET32a(+)原核表达载体上成功构建了表达裁体pET32a-σC.该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1.0 mmol/L IPTG诱导5 h得到最佳表达.表达重组蛋白的相对分子质量为54 000,以包涵体形式存在.经Western-blot分析表明,该重组蛋白能于ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性.     

中内毒素（LPS）诱导后家蝇幼虫抗菌肽CecMd基因的克隆、生物信息学分析及其表达载体的构建

从脂多糖（LPS）诱导或非诱导的家蝇幼虫体内抽提总RNA,根据家蝇Cecropin基因（GenBank：DQ 232774）设计特异性引物,应用RT—PCR技术扩增出编码CecMd开放阅读框（ORF）的eDNA序列,将其克隆入pMD18-T载体,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将CecMd亚克隆基因与线性化的pET32a（＋）连接,构建重组表达载体pET32a（＋）／CecMid,并对此基因及其推导氨基酸序列进行系统的生物信息学分析。结果表明从脂多糖（LPS）诱导的家蝇幼虫体内成功的扩增出家蝇抗菌肽Cecropin基因,命名为CecMd,但是从未诱导的虫体内未能获得此基因;CecMd开放阅读框的cDNA全长为192bp,编码由63个氨基酸残基组成的多肽;此多肽最可能的裂解位点在氨基酸残基A23和G24之间,提示1～23氨基酸残基组成信号肽,24～63氨基酸残基构成成熟肽;CecMd的全长肽包含4个螺旋,成熟肽（不包括信号肽）含有2个螺旋,两者均不合二硫键;CecMd与果蝇Cecropins的同源性显著高于其他昆虫,达到81．0％以上;经PCR,限制酶切和DNA测序鉴定表明,成功构建了重组表达载体pET32a（＋）／Cec Md 。重组表达载体pET32a（＋）／Cec Md的构建及其CecMd基因的生物信息学分析对其生物学功能研究和高效表达工程菌的构建具有重要意义。     

猪细小病毒SH-1株VP2和NS1基因的克隆与原核表达

通过PCR技术,从感染了猪细小病毒的ST细胞中扩增出猪细小病毒的VP2基因和NS1基因,并将其亚克隆至原核表达载体中,分别构建了重组表达载体pET32c/VP2和pET30a/NS1,经IPTG诱导,使pET32c/VP2和pET30a/NS1在受体菌BL21(DE3)中得到高效表达。经Western-blot检测具有生物学活性,为猪细小病毒野毒与疫苗毒的鉴别诊断奠定基础。     

山羊痘病毒南疆株P32基因的原核表达及其结构分析

为了研究新疆南疆分离的山羊痘病毒P32基因的特征,试验通过PCR扩增得到P32基因及其膜外区P32_(1～282)基因和膜外亲水区P32_(20～270)基因,分别构建了表达载体(pET42b-P32、pET42b-P32_(1～282)和pET28a-P32_(20～270))并进行了原核表达,对其核苷酸序列的同源性、遗传进化关系及推测的氨基酸序列、蛋白质二级结构进行了预测分析。结果表明:山羊痘病毒南疆株P32基因发生了较大突变,相对对照在第100～105位增加了6个核苷酸,编码K、N两个氨基酸,全长达到975 bp,编码324个氨基酸,与Gansu 2009株相似。跨膜分析显示P32蛋白膜外区为1～282位氨基酸,跨膜区为283～305位氨基酸,膜内区为306～324位氨基酸。二级结构分析发现其分子两端呈明显的疏水结构,抗原性较弱,而中间区域有较强的亲水性和较强的抗原性。蛋白质表达发现其全长在大肠杆菌中几乎没有表达,其膜外区可以表达,但表达量较低,难以纯化。说明山羊痘病毒P32蛋白是一个典型的膜蛋白,全长较难表达纯化,南疆株P32蛋白也具有这样的特性。     

猪圆环病毒2型多抗原表位串联在大肠杆菌中表达与反应原性分析

为将猪圆环病毒2型(PCV2)的多个抗原表位串联,并在大肠杆菌中表达,本研究人工合成PCV2多抗原表位串联的编码序列并与pET32a(+)载体连接构建重组表达质粒。将其转化到BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达。检测结果显示,多抗原表位串联基因在大肠杆菌中获得表达并以包涵体形式存在;表达的融合蛋白分子量约为27 ku。将包涵体溶解并经Ni-His柱纯化得到纯化的目的蛋白,western blot和ELISA结果显示,该表达产物具有较好的反应原性。     

猪链球菌2型38 000蛋白主要功能区基因的克隆与表达

根据GenBank中已发表的猪链球菌2型38000蛋白基因核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,采用PCR方法,以四川分离株猪链球菌2型基因组DNA为模板扩增38000蛋白主要功能区基因。将PCR产物纯化后与pMD18-T连接转化宿主菌DH5α,提取阳性质粒,进行PCR和酶切鉴定。将目的片段定向克隆到表达载体pET32a中,经测序正确后,重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),于37℃、0.8mmol/LIPTG条件下进行诱导表达,结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量约为35000的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western blotting)证实该重组蛋白可以与猪链球菌2型阳性血清发生特异性反应。     

布鲁菌VirB5基因的克隆和原核表达及其蛋白纯化

布鲁菌Ⅳ型分泌系统是其重要的毒力因子之一,研究其组分中VirB5基因的作用对于阐明布鲁菌的致病机制具有重要意义。应用PCR技术从B.suis S2菌株中扩增VirB5基因,克隆到pMD19T-simple载体,经EcoRⅠ、XhoⅠ酶切,与表达载体pET32a连接,得到重组质粒pET32a-VirB5,测序鉴定正确后,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导并确定最佳诱导条件,采用Ni柱纯化重组蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明,克隆了717 bp大小的VirB5基因,构建了重组质粒pET32a-VirB5,诱导条件筛选表明,在37℃、菌液OD_(600)值约为0.6时,用1.0 mmol/L IPTG诱导6 h,蛋白表达量最高,表达的蛋白分子质量约为45 ku,且主要以包涵体的形式存在,研究结果为布鲁菌致病机制的研究提供了材料。