猫疱疹病毒1型的分离鉴定及gD基因序列分析

为研究猫疱疹病毒1型(FHV-1)的分子流行病学特征,对2016年-2017年从洛阳及天津地区多家宠物医院收集的具有上呼吸道感染症状的病猫眼鼻拭子样品,用FK-81细胞进行病毒分离,通过间接免疫荧光试验、电镜形态观察和gD基因测序分析等方法鉴定所分离的病毒,并进行病毒体外生长动力学研究。结果显示,病料在FK-81细胞上接种后24 h^36 h呈现变圆、融合、局灶性堆积聚团和脱落等细胞病变;分离毒株可被FHV-1单克隆抗体特异性识别;电镜下可观察到病毒粒子呈圆形、有囊膜、直径约130 nm,具有疱疹病毒科的典型形态特征,将所分离到的5株FHV-1分别命名为2016TJ1株、2016TJ2株、2017LY1株、2017LY2株和2017LY3株;病毒一步生长曲线测定结果显示,接种后12 h^36 h病毒快速增殖,40 h^60 h病毒滴度达到高峰,72 h病毒滴度开始下降;5株FHV-1 gD基因序列之间的同源性为100%,核酸序列高度保守且与国内外流行株及疫苗株的同源性极高。研究结果为我国宠物猫群中FHV-1的病原分离、分子流行病学调查等研究积累了资料。     

虎源传染性鼻气管炎病毒巢式PCR检测方法的建立

为了建立虎源传染性鼻气管炎病毒巢式PCR(nested PCR)的快速鉴定方法,根据虎源传染性鼻气管炎病毒(FHV-1)的gD蛋白基因序列设计套式引物,进行特异性、敏感性和重复性实验,特异性试验表明,该方法可以特异扩增出FHV-1的gD基因片断,从猫泛白细胞减少症病毒、猫支原体和阴性对照的VERO细胞均未扩增出该条带,敏感性试验表明,nested PCR检测极限是1×10~2 copies/μl,而一步法PCR的有效扩增最低极限是1×10~5 copies/μl,前者的敏感性明显高于后者,重复性实验表明,不同情况下3次重复性试验,结果相同。用nested PCR对疑似感染FHV-1的样品进行检测,实验结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究建立的nested PCR适用于野生猫科动物FHV-1感染的快速诊断与流行病学调查。     

一株猫疱疹病毒Ⅰ型的分离与鉴定

采集哈尔滨某猫舍中表现为上呼吸道感染的患病猫眼、鼻拭子，PCR初步确诊为猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒(FHV-1)混合感染。利用猫肾细胞(CRFK)对样本进行病毒分离，前两代细胞培养物的核酸检测结果为FHV-1和FCV阳性，第三代开始只有FCV阳性，由此分离出FCV。制备此株FCV的鼠源多克隆抗体，并中和混合培养物中的FCV,从而分离出FHV-1,命名为HRB2019株。通过病毒粒子形态观察、间接免疫荧光试验(IFA)和基因序列分析等方法鉴定HRB2019株，并研究其体外生长动力学。结果显示，HRB2019株可在CRFK细胞上产生典型病变，测得其第四代病毒滴度为1×10^8.43TCID₅₀·mL^-1;电镜下可观察到球形、有囊膜、直径约为200 nm的病毒粒子；IFA结果显示，分离株可与FHV-1阳性血清结合，出现特异性荧光；扩增分离株的gD基因，其与国内外流行株高度同源。病毒一步生长曲线表明，HRB2019株感染细胞12 h后开始复制增殖，12～36 h为快速增殖期，48～72 h进入增殖平台期且滴度达到高峰，84 ...     

狮源猫细小病毒分离鉴定及其VP2基因序列分析

为对疑似感染猫细小病毒的非洲狮进行确诊，了解猫细小病毒的流行特点，通过猫肾细胞（F81细胞）对非洲狮粪便样品进行病毒分离并通过PCR鉴定，对检测到的细小病毒进行VP2基因扩增和分析。结果显示：成功从非洲狮粪便中分离出1株细小病毒，将其命名为FPV CHN-HN-1。该病毒接种到F81细胞上，能使细胞出现拉丝、脱落现象。该分离株与参考的26株细小病毒分离株相似性为97.8%~100%，其中与分离株JN-FPV-96（MZ836373.1）、TZ-FPV-112（MZ836368.1）、FPV-SH2003（MW811187.1）和BJ051（MT270580.1）相似性高达100%；与其他7株猫源细小病毒同属一个分支，与JN-FPV-96、TZ-FPV-112、FPV-SH2003、BJ051遗传距离最近，与其他参考毒株遗传距离较远。本研究为细小病毒病的诊断和治疗提供了依据，也为后期疫苗的研制打下了基础。     

猫传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

猫传染性鼻气管炎(FIR)病毒是引起猫传染性鼻气管炎的病原,属于猫疱疹病毒1型(FHV-1)。选择FHV-1gD基因设计1对引物FHV-1F、FHV-1R和探针FHV-1Probe,建立FHV-1实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法可以特异地检测出FHV-1的DNA,敏感性达到75fg/μL,反应效率达到107%,R²值为0.9965,Ct值的变异系数低于2%。FHV-1实时荧光定量PCR检测方法敏感性高于普通PCR,特异性好、稳定性好,适用于FHV-1的临床诊断、检测和流行病学调查。利用该方法对上海地区宠物门诊送检的疑似FHV-1感染的样品进行检测,其阳性率达到27.78％,表明上海地区宠物猫FHV-1的发病率处于较高水平。     

猫细小病毒的分离与鉴定

利用F81传代细胞从病死猫脾脏中分离获得1株病毒,该毒株可使培养细胞出现明显的细胞病变（CPE）。并对其进行形态学、理化学、人工感染试验和分子病毒学等鉴定,证明所分离的这株病毒为猫细小病毒。     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立与初步应用

建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,应用于临床样品中FHV-1的快速检测。根据猫疱疹病毒Ⅰ型的gI基因序列设计了一对特异性引物,以疑似猫疱疹病毒Ⅰ型感染猫的眼鼻分泌物总DNA为模板,建立了PCR检测方法,对所建立的方法进行特异性、敏感性和重复性验证,并对26份临床样本进行检测。结果表明,所建立的PCR诊断方法与犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、绵羊肺炎支原体(M.ovis)、牛支原体(M.bovis)、牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)均无交叉性反应,最低检测DNA模板浓度为3.23×10~3 copies/μL。对26份临床病例进行检测,阳性率61.54%。说明建立的FHV-1PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、方便快捷等优点,适合于临床FHV-1感染的快速检测。     

猫病毒性鼻气管炎PCR检测方法的建立与应用

猫病毒性鼻气管炎(FR)又称猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)可引起猫的上呼吸道感染,是一种猫的常见的急性、高度接触性上呼吸道疾病[1-2].病猫精神沉郁,打喷嚏,食欲下降,结膜炎,浆液性的眼鼻分泌物,体温升高,深部的气管咳嗽[3].慢性感染病例舌头和上颔出现溃疡.FHV-1只感染猫及猫科动物,主要侵害幼猫,发病率达100%[4],死亡率约为50%[5].若怀孕猫感染,可造成流产[6].     

犬细小病毒TZ2#株的分离与鉴定

采集疑似犬细小病毒(CPV)感染犬的粪便,采用同步培养法接种胎猫肾细胞(FK81)进行病毒分离鉴定。通过PCR检测、HA试验、PEG纯化,获得1株犬细小病毒,并命名为TZ2#株。感染的F81细胞48h后出现明显的细胞病变;在感染的FK81细胞中扩增出CPV基因的特异性片段;病毒液可凝集猪红细胞,血凝价为1∶64,其血凝性能被特异性抗体抑制。     

猫疱疹病毒1型HR-1毒株的分离鉴定及致病性分析

从哈尔滨市某宠物医院疑似感染1型猫疱疹病毒发病猫的眼、鼻拭子中分离到1株病毒,经过电镜观察、分子生物学、血清学和动物回归试验鉴定,分离到的病毒为猫疱疹病毒1型,命名为HR-1株。HR-1可在猫肾细胞(CRFK)上产生典型细胞病变,病毒滴度可达到10~(8 )TCID_(50)/mL。提取病毒基因组DNA经过gD引物扩增后,得到1条1 125 bp大小的特异性条带,经测序表明其与C-27毒株gD基因序列相似性达100%。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,接种HR-1的单层CRFK细胞出现特异性荧光。电镜观察可见圆形、有囊膜、直径约为150 nm的病毒颗粒。为了解该毒株的毒力及致病性,通过感染中国家猫进行致病性试验。结果表明,HR-1为强毒株,对家猫的致死率为100%;HR-1感染家猫后主要表现为眼结膜炎和鼻气管炎;通过实时荧光定量PCR能从感染家猫的眼、鼻拭子中检测到病毒粒子核酸,并且于感染后4～6 d病毒核酸达到最高峰。本试验为猫疱疹病毒的诊断和致病机制的研究提供了参考价值.     

犬细小病毒昆明流行株的分离鉴定与VP2基因序列分析

为了解昆明市犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)流行及抗原变异情况,有针对性地筛选疫苗及研发新疫苗,本研究从昆明市部分宠物医院收集6份疑似CPV粪便样品进行病毒分离培养,对获得的疑似病毒液进行PCR、免疫荧光试验(IFA)、血凝效价测定、TCID50测定及VP2基因序列分析。结果显示,分离的1株病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变(CPE),PCR扩增产物大小为164bp,IFA鉴定感染的F81细胞出现绿色荧光,血凝效价为1∶512,病毒TCID50为10-4.375/0.1mL,VP2基因PCR扩增条带大小为1 755bp。对分离株VP2结构蛋白进行测序分析,判定该分离株为CPV-2a亚型,与标准毒株存在5个变异氨基酸位点,属于变异株。将测序结果与商品化疫苗株及国内参考株序列进行比对分析,结果显示与弱毒苗Intervet/vaccine/06和Pfizer/vaccine/06核苷酸同源性均为98.7%;与国内参考毒株序列同源性为98.2%～99.5%,与ANTU-1和WH02/06株同源性最高;与ANTU-1株、WH02/06株及BJ01株亲缘关系最近,位于进化树的同一簇。本研究对监测CPV的遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。     

犬细小病毒昆明流行株的分离鉴定与VP2基因序列分析

为了解昆明市犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)流行及抗原变异情况,有针对性地筛选疫苗及研发新疫苗,本研究从昆明市部分宠物医院收集6份疑似CPV粪便样品进行病毒分离培养,对获得的疑似病毒液进行PCR、免疫荧光试验(IFA)、血凝效价测定、TCID50测定及VP2基因序列分析。结果显示,分离的1株病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变(CPE),PCR扩增产物大小为164bp,IFA鉴定感染的F81细胞出现绿色荧光,血凝效价为1∶512,病毒TCID50为10-4.375/0.1mL,VP2基因PCR扩增条带大小为1 755bp。对分离株VP2结构蛋白进行测序分析,判定该分离株为CPV-2a亚型,与标准毒株存在5个变异氨基酸位点,属于变异株。将测序结果与商品化疫苗株及国内参考株序列进行比对分析,结果显示与弱毒苗Intervet/vaccine/06和Pfizer/vaccine/06核苷酸同源性均为98.7%;与国内参考毒株序列同源性为98.2%～99.5%,与ANTU-1和WH02/06株同源性最高;与ANTU-1株、WH02/06株及BJ01株亲缘关系最近,位于进化树的同一簇。本研究对监测CPV的遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。     

猫传染性鼻气管炎病毒的分离与鉴定

采用直接免疫荧光和测序方法对5株病毒分离株进行了病毒的鉴定;并采用免疫学、化学和生物学方法对这5株病毒分离株进行了研究。结果显示,5株病毒分离株被鉴定为猫疱疹病毒I型;g D序列未发生变化;病毒仅在F81细胞中增殖,能引起F81细胞明显的细胞病变;猫、公鸡、人O型、牛、猪、兔、绵羊的红细胞不具有凝集作用;病毒对pH3.0、有机溶剂和60℃高温敏感;病毒蚀斑形成单位为3×10~6个PFU/m L,纯化株TCID50值为10~(-5.0)TCID_(50)/0.1m L。该研究结果表明,上海地区宠物猫存在猫传染性鼻气管炎流行风险,其病原为猫疱疹病毒I型且部分病原特性未发生变化。     

贵阳地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为研究贵阳地区犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）的流行基因型及其遗传进化情况,本试验对从贵阳市分离的10株CPV的VP2基因进行PCR扩增和克隆并进行序列分析。结果显示,分离的病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变（CPE）,分离的10株病毒中,7株为CPV-2a亚型,3株为CPV-2c亚型,命名为GY-1~GY-10。10株CPV分离株与疫苗株VP2基因的同源性98.4%~99.4%,与其他国内外参考株的同源性为97.7%~99.9%。本试验首次报道贵阳市CPV的流行基因型为CPV-2a亚型并伴随CPV-2c亚型存在,对监测CPV遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。     

犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定

采集疑似细小病毒(CPV)感染犬的粪便,采用同步培养法接种胎猫肾细胞(F81)进行病毒分离鉴定。通过PCR检测、HA试验、IFA鉴定、电镜观察和空斑纯化,获得1株犬细小病毒,并命名为HZ0761。感染的F81细胞48h后出现明显的细胞病变;在病料和感染的F81细胞中均扩增出CPV VP2基因的特异性片段(221 bp);病毒液可凝集猪红细胞,血凝价为1∶28,其血凝性能被特异性抗体抑制;IFA可见特异性亮绿色荧光;电镜观察感染的F81细胞核内可见20 nm左右的病毒颗粒;病毒液的TCID50为10-4.8/mL,VP2基因序列分析显示该毒株为CPV-2 a型。     

犬细小病毒敦化株的分离与鉴定

为了丰富我国延边地区犬细小病毒流行病学研究资料,为进一步研究有效的疫苗及诊断试剂做前期基础工作。采集延边州敦化市地区疑似犬细小病毒感染病犬的粪便样品,经过预处理后同步接种猫肾细胞(F81),盲传至细胞出现明显病变,经形态学、分子生物学、免疫学等方法进行分析鉴定。结果:分离到的病毒可使F81细胞出现特异性病变、电镜下可见清晰的病毒粒子、其培养物可使红细胞发生凝集且能被特异性阳性血清所抑制、用特异性引物进行PCR检测结果呈阳性、免疫荧光试验可见培养物出现特异性绿色荧光,针对其VP2序列建立的进化树显示其与new CPV-2b型犬细小病毒有较高的同源性。结论:通过上述试验确定分离出1株犬细小病毒,分离的病毒为new CPV-2b型,命名CPV-DH-3株。     

1株猫杯状病毒的分离鉴定及其ORF2序列的遗传演化分析

为了解猫杯状病毒形态特征及遗传演化情况,采用F81细胞从患病宠物猫的鼻拭子样品中分离获得1株猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV),命名为SH1。经电镜观察,病毒粒子呈球形,无囊膜,符合FCV的形态特征。采用RT-PCR方法扩增了该毒株的全基因组,并进行了序列测定和衣壳蛋白基因(ORF2)序列的分析。结果显示:分离株与国内外参考株的ORF2序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为74.1%~79.7%和84.5%~90.9%;ORF2基因的遗传演化分析显示,30株FCV毒株形成两大分支,即基因群Ⅰ和Ⅱ,分离株属于基因群Ⅰ;进一步分析发现,基因群Ⅰ和Ⅱ主要在377、539和557氨基酸位点存在差异,基因群Ⅰ和Ⅱ分别为N、A、G和K、V、S。研究结果为FCV感染的防控提供科学依据。     

山东省青岛市猫病毒性鼻气管炎流行情况调查

为了解山东省青岛市猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的流行情况,2019年6月至2021年6月共采集猫眼鼻拭子样本218份,提取样本DNA后利用PCR方法进行FHV-1核酸检测,共检出阳性样本22份,阳性率为10.1%(22/218)。宠物救助站猫的FHV-1阳性率(16.7%)略高于其他来源猫,2~6月龄幼猫的FHV-1阳性率(13.6%)略高于成年猫(7.0%),成年公猫阳性率(7.3%)稍高于成年母猫(6.7%),但各组间均无显著性差异(P>0.05)。对2021年3月采集的60份猫血清进行了FHV-1中和抗体检测,共检出阳性样本40份,抗体阳性率为66.7%。结果表明,青岛市猫群中存在一定的FHV-1流行,抗体保护水平不高,应加快国产FHV-1相关疫苗的研制,及时对猫进行免疫预防。     

禽传染性喉气管炎病毒分离鉴定及gD基因序列分析

河北省沧州市某养鸡场饲养的510日龄蛋鸡发生急性上呼吸道疫病。为确定病因,采集发病鸡气管组织样品处理后接种鸡胚,利用特异性引物进行禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）、禽传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、J型禽白血病病毒等有关病原的PCR扩增,结果从接种病毒的鸡胚绒毛尿囊液中只扩增出ILTV gD基因片段（1 133 bp）,将分离的毒株命名为Hebei2021株;将分离株扩增产物连接载体构建质粒,测序后进行核苷酸序列同源性分析、氨基酸序列比对,并对分离株及参考株gD基因序列进行遗传进化分析,利用在线预测服务器预测gD蛋白二级结构及糖基化位点。结果显示：分离株与国内外参考株及疫苗株gD基因的核苷酸同源性均在99.0%以上,与参考毒株相比仅极个别氨基酸序列位点发生突变;分离株与江苏省分离株之外的国内其他分离株均在同一进化分支上,与疫苗株相比其糖基化位点并未发生突变。结果表明,此次河北省分离株gD基因较为保守,变异程度较低,当前疫苗对ILTV依然有较好的免疫保护力。本研究为禽传染性喉气管炎的流行病学调查和疫苗选择提供了参考。     

猫疱疹病毒Ⅰ型、猫杯状病毒、支气管败血波氏杆菌多重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

旨在建立检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1,FHV-1)、猫杯状病毒(Feline calicivirus, FCV)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)多重TaqMan荧光定量PCR方法。基于FHV-1的胸苷激酶(TK)基因、FCV的衣壳蛋白VP1基因、Bb的皮肤坏死毒素基因(DNT1)序列保守区域设计并合成TaqMan荧光定量PCR引物和探针,以FHV-1、FCV、Bb、猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌为模板验证引物和探针的特异性。制备重组质粒pMD18T-FHV-TK、pMD18T-FCV-VP1、pMD18T-Bb-DNT1作为标准品,经矩阵法确定最佳反应体系。以10倍梯度稀释的标准品为模板检测方法的灵敏性。应用建立的方法对32份临床具有上呼吸道感染症状的猫眼、口、鼻拭子检测,以评估该方法的可行性。结果显示：该方法可特异性检出FHV-1、FCV、Bb,且与猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;灵敏度试验表明该方法对FHV-1、FCV、Bb的最低检出限分别为10、10和100拷贝/μL;应用该方法从3...