犬细小病毒昆明流行株的分离鉴定与VP2基因序列分析

为了解昆明市犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)流行及抗原变异情况,有针对性地筛选疫苗及研发新疫苗,本研究从昆明市部分宠物医院收集6份疑似CPV粪便样品进行病毒分离培养,对获得的疑似病毒液进行PCR、免疫荧光试验(IFA)、血凝效价测定、TCID50测定及VP2基因序列分析。结果显示,分离的1株病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变(CPE),PCR扩增产物大小为164bp,IFA鉴定感染的F81细胞出现绿色荧光,血凝效价为1∶512,病毒TCID50为10-4.375/0.1mL,VP2基因PCR扩增条带大小为1 755bp。对分离株VP2结构蛋白进行测序分析,判定该分离株为CPV-2a亚型,与标准毒株存在5个变异氨基酸位点,属于变异株。将测序结果与商品化疫苗株及国内参考株序列进行比对分析,结果显示与弱毒苗Intervet/vaccine/06和Pfizer/vaccine/06核苷酸同源性均为98.7%;与国内参考毒株序列同源性为98.2%～99.5%,与ANTU-1和WH02/06株同源性最高;与ANTU-1株、WH02/06株及BJ01株亲缘关系最近,位于进化树的同一簇。本研究对监测CPV的遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。     

犬细小病毒CPV-BJ03/17株分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了研究当前犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）国内流行株的遗传变异情况,试验从北京某宠物基地采集疑似CPV感染死亡犬的肠道组织,无菌处理病料后,用F81细胞进行病毒培养,通过电镜形态学观察、血清学、分子生物学和攻毒试验进行鉴定。结果表明,病毒在F81细胞上出现明显的细胞病变（CPE）,电镜观察可见直径20 nm左右的病毒粒子,血凝效价1：256,PCR鉴定在570 bp处有特异性条带,证明分离出1株CPV,命名为CPV-BJ03/17。全基因组测序分析表明,病毒基因组全长4 620 bp,提交GenBank,登录号为：MF134808;该毒株与广东（SC02/2011）、深圳（CPV-s5）和甘肃（CPV-LZ1）等地的分离株亲缘关系较近,核苷酸同源性均为99.7%。VP2氨基酸序列分析表明,CPV-BJ03/17分离株确定为New CPV-2a亚型,主要氨基酸位点与近期分离株BJ15-1等相比无明显变化。动物回归试验表明,CPV-BJ03/17为CPV强毒株。本研究分离出1株CPV强毒株,通过比较CPV的流行情况和遗传变异规律,为CPV的疾病治疗及疫苗研究提供参考。     

犬细小病毒CPV-BJ03/17株分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了研究当前犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)国内流行株的遗传变异情况,试验从北京某宠物基地采集疑似CPV感染死亡犬的肠道组织,无菌处理病料后,用F81细胞进行病毒培养,通过电镜形态学观察、血清学、分子生物学和攻毒试验进行鉴定。结果表明,病毒在F81细胞上出现明显的细胞病变(CPE),电镜观察可见直径20nm左右的病毒粒子,血凝效价1∶256,PCR鉴定在570bp处有特异性条带,证明分离出1株CPV,命名为CPV-BJ03/17。全基因组测序分析表明,病毒基因组全长4 620bp,提交GenBank,登录号为:MF134808;该毒株与广东(SC02/2011)、深圳(CPV-s5)和甘肃(CPV-LZ1)等地的分离株亲缘关系较近,核苷酸同源性均为99.7%。VP2氨基酸序列分析表明,CPV-BJ03/17分离株确定为New CPV-2a亚型,主要氨基酸位点与近期分离株BJ15-1等相比无明显变化。动物回归试验表明,CPV-BJ03/17为CPV强毒株。本研究分离出1株CPV强毒株,通过比较CPV的流行情况和遗传变异规律,为CPV的疾病治疗及疫苗研究提供参考。     

广西地区犬细小病毒检测及VP2基因序列分析

为了调查广西地区犬细小病毒(CPV)的优势毒株及其遗传变异情况,试验利用PCR方法对采自广西地区的423份犬血清样本进行CPV检测并扩增其VP2基因,利用MegAlign软件进行同源性比对并分析VP2蛋白主要突变的氨基酸位点,同时利用MEGA 7.0软件采用邻接法构建遗传进化树。结果表明：共获得55份CPV阳性血清样本,阳性率约为13.0%。PCR扩增得到大小约为1 755 bp的VP2基因。55株分离毒株之间的相似性为98.6%～100%;分离毒株与国内外参考毒株的相似性为97.4%～100%,与疫苗株Pfizer/vaccine/06的相似性为98.3%～98.9%。扩增序列的推导氨基酸主要在第5,297,370,426,440位发生变异。在55株分离毒株中,有32株为New CPV-2a亚型毒株,20株为CPV-2c亚型毒株,3株为New CPV-2b亚型毒株。55株分离毒株形成3个主要的流行分支,与国内参考毒株的亲缘关系较近,而与国外参考毒株、猫细小病毒的亲缘关系较远。说明New CPV-2a、CPV-2c、New CPV-2b亚型毒株在广西地区流行广泛,正逐步取代CPV-2a...     

犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定

采集疑似细小病毒(CPV)感染犬的粪便,采用同步培养法接种胎猫肾细胞(F81)进行病毒分离鉴定。通过PCR检测、HA试验、IFA鉴定、电镜观察和空斑纯化,获得1株犬细小病毒,并命名为HZ0761。感染的F81细胞48h后出现明显的细胞病变;在病料和感染的F81细胞中均扩增出CPV VP2基因的特异性片段(221 bp);病毒液可凝集猪红细胞,血凝价为1∶28,其血凝性能被特异性抗体抑制;IFA可见特异性亮绿色荧光;电镜观察感染的F81细胞核内可见20 nm左右的病毒颗粒;病毒液的TCID50为10-4.8/mL,VP2基因序列分析显示该毒株为CPV-2 a型。     

犬细小病毒上海株的分离与鉴定

为研究上海地区犬细小病毒的流行情况,采集疑似犬细小病毒感染犬的肠内容物,无菌处理病料后同步接种猫肾脏F81细胞,盲传至第5代出现细胞病变,从肠内容物中分离出1株病毒。采用细胞培养病变观察、病毒形态学鉴定、直接免疫荧光抗体检测、细胞敏感谱试验、红细胞凝集试验、部分理化特性鉴定和VP2序列的测定等方法,鉴定分离株为犬细小病毒,命名为CPV-2/canine/Shanghai/01/2018。该病毒的TCID50为105.3/0.1 mL,血凝效价为28,病毒测得VP2基因序列的全长为1 755 bp。与已知序列比较,其核苷酸同源性为98.3%～99.1%,氨基酸同源性为97.3%～99.3%。对其VP2基因的氨基酸序列进行分析,确定该细小病毒属于CPV-2c亚型。研究提示,上海地区CPV存在不同的基因亚型,在进行疫苗免疫时应当选择正确的疫苗株。     

犬细小病毒北京分离株的鉴定及其全基因组序列分析

首先对疑似犬细小病毒(CPV)感染的病犬粪便进行特异性PCR扩增,经目的片段测序分析,初步证明为CPV感染。将该病犬粪便处理物接种F81细胞,自第3代起,细胞出现典型CPE。对该株病毒进行电镜观察、理化特性试验、HA-HI及基因型等方面鉴定,证明该分离株为CPV,命名为CPV/BJ-L1株。该分离株的血凝效价为1∶512,其血凝性能被特异性抗体抑制;Reed-Muench法测定分离株病毒TCID_(50)为10-5.15/0.1 mL;电镜观察可见25nm左右的病毒颗粒;动物回归试验显示,攻毒犬能复制出CPV的典型临床症状和病理变化;对分离株的全基因组(包含两端完整的发夹结构序列)进行克隆、测序与分析。结果表明,BJ-L1为CPV-2a亚型,与GenBank中的21株CPV全基因序列核苷酸同源性为98.8%~99.8%,且与国内近期分离毒株高度同源。对2006-2014年北京市CPV分离株VP2基因进行序列分析,结果显示,CPV流行株的变异具有某种时间相关性。     

南宁地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为了解广西南宁地区犬细小病毒(CPV)的流行现状与病毒变异情况,本试验对初步确诊为犬细小病毒病的12份阳性病料提取基因组DNA,以提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增VP2基因序列并测序,将12个阳性毒株样本VP2基因测序结果与GenBank中登录的17株国内外CPV分离株VP2基因进行同源性比对,采用Mega 7.0软件绘制遗传进化树,分析其病毒亚型和遗传进化情况。结果显示,成功扩增得到12个毒株样本的VP2基因片段,大小约1 755bp,12株阳性样本毒株的VP2基因同源性在99.2%～100.0%之间,其中NN01与NN07、NN02与NN06同源性最高,为100.0%;阳性样本毒株与国内其他分离株VP2基因的同源性为97.6%～100.0%,其中NN08、NN10及NN04与CPV-ZJ1579同源性最高,均为100.0%,属于CPV-2a亚型;阳性样本毒株与国外代表性毒株同源性在98.1%～99.8%之间。遗传进化树分析表明,12个样本毒株中有3株属于CPV-2a亚型,3株属于CPV-2b亚型,6株属于CPV-2c亚型。这是继2018年初广西分离到CPV-2c型CPV后,首次发现南宁地区大规模流行CPV-2c亚型病毒,预示着CPV-2c亚型CPV在国内的流行正在增加。综上所述,广西南宁地区CPV-2a、CPV-2b与CPV-2c亚型并存,但CPV-2c亚型的比重比其他地区大,这也给该地区提供了新的防治信息,在实际CPV防控工作中除了对CPV-2a、CPV-2b等传统流行亚型的关注之外,更应该重视CPV-2c亚型CPV的防控。     

南宁地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为了解广西南宁地区犬细小病毒（CPV）的流行现状与病毒变异情况,本试验对初步确诊为犬细小病毒病的12份阳性病料提取基因组DNA,以提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增VP2基因序列并测序,将12个阳性毒株样本VP2基因测序结果与GenBank中登录的17株国内外CPV分离株VP2基因进行同源性比对,采用Mega 7.0软件绘制遗传进化树,分析其病毒亚型和遗传进化情况。结果显示,成功扩增得到12个毒株样本的VP2基因片段,大小约1 755 bp,12株阳性样本毒株的VP2基因同源性在99.2%~100.0%之间,其中NN01与NN07、NN02与NN06同源性最高,为100.0%;阳性样本毒株与国内其他分离株VP2基因的同源性为97.6%~100.0%,其中NN08、NN10及NN04与CPV-ZJ1579同源性最高,均为100.0%,属于CPV-2a亚型;阳性样本毒株与国外代表性毒株同源性在98.1%~99.8%之间。遗传进化树分析表明,12个样本毒株中有3株属于CPV-2a亚型,3株属于CPV-2b亚型,6株属于CPV-2c亚型。这是继2018年初广西分离到CPV-2c型CPV后,首次发现南宁地区大规模流行CPV-2c亚型病毒,预示着CPV-2c亚型CPV在国内的流行正在增加。综上所述,广西南宁地区CPV-2a、CPV-2b与CPV-2c亚型并存,但CPV-2c亚型的比重比其他地区大,这也给该地区提供了新的防治信息,在实际CPV防控工作中除了对CPV-2a、CPV-2b等传统流行亚型的关注之外,更应该重视CPV-2c亚型CPV的防控。     

广东珠三角地区犬细小病毒分离与鉴定

为了解珠三角地区犬细小病毒(CPV)的流行情况及研制有效的疫苗,本研究开展了CPV流行病学调查,并将32份疑似CPV感染犬的粪便样品处理后接种F81细胞进行病毒分离,并对分离株进行鉴定。鉴定结果显示:32份样品中有19份样品提取液在F81细胞上可以产生明显的细胞病变;HA效价可达到1∶256。回归动物试验显示分离株可以导致犬出现明显的CPV感染症状,PCR鉴定也进一步确定所分离的病毒为CPV。通过VP2基因同源性分析显示分离株与国内主要的流行基因亚型CPV-2a的同源性达98%以上。     

一株犬细小病毒CPV-2a变异株的分离鉴定及生物学特性研究

为研究犬细小病毒(CPV)地方分离株的变异情况,本研究从洛阳市某宠物医院临床表现为出血性肠炎的患犬肛拭子样品中分离到一株病毒,对其进行血凝试验、间接ELISA试验、PCR试验及动物回归试验。结果表明该病毒分离株能够凝集猪红细胞;利用兔抗CPV血清进行检测,结果呈阳性。采用CPV检测引物进行PCR扩增,获得大小为559 bp的特异性片段,并且利用针对CPV VP2基因设计的特异性引物能够扩增到大小为1 755 bp的特异性片段。同源性比较和进化树分析均表明该分离株为一株CPV,将其命名为CPV-henan32-2013。氨基酸序列分析表明该分离株为CPV-2a型,并且发生了T322S、Y324I、P333A、A334G、S348C 5个位点突变。动物回归试验复制出了CPV典型症状的出血性肠炎、心包液增多及肺脏水肿充血。病理切片观察可见心肌细胞、肠粘膜上皮细胞和肺脏均有出血、坏死或脱落等特异性病变。本实验结果为进一步了解CPV的变异规律、疫苗株的选择和CPV病的有效防控奠定了基础。     

猪圆环病毒2型2015JS株的分离鉴定及全基因序列分析

采用细胞传代法对PCR检测为猪圆环病毒2型(PCV2)阳性的病料进行病毒分离,通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)对分离的病毒进行初步鉴定,应用IFA测定分离株的TCID50。应用PCR特异性扩增出该分离株的全基因组,经测序后进行同源性和系统进化分析。结果:成功分离到1株PCV2毒株,全基因组长度为1 766 bp,命名为2015JS株,分离株在细胞上的TICD50为10-5.50,与乌拉圭毒株Uy99(Gen Bank登录号KP867050)的同源性最高(99.8%),同属PCV2d型;与丹麦PCV2c毒株DK1980PMWSfree(Gen Bank登录号EU148503)的同源性最低(94.3%)。研究结果为江苏PCV2流行病学的研究和遗传变异的防控提供了参考资料,也为江苏PCV2疫苗毒株提供了选择依据。     

番鸭细小病毒NS和VP基因的克隆及序列分析

为进一步了解番鸭细小病毒(MDPV)基因的遗传变异特征，本试验采用分段PCR扩增法获得了2个MDPV安徽分离株(AH1901和AH1902)基因组NS和VP全长基因，并与GenBank数据库中的20个水禽细小病毒基因组序列进行了比对。序列分析显示，克隆的MDPV基因均包括完整的NS和VP基因，分别为1 884 bp和2 199 bp,VP基因核苷酸序列变异程度相对较高，而NS基因则较为保守；进化分析显示，安徽分离株AH1901和AH1902位于同一分支，二者与国内分离的MDPV毒株ZJ-JH-2013基因遗传距离最近，可能来源于同一毒株，与MDPV疫苗株P1及国外分离毒株FM基因遗传距离则较远；安徽分离株AH1901和AH1902的NS基因序列同源性为99.8%,VP基因序列一致。两者的NS、VP基因序列与分离株ZJ-JH-2013的同源性最高，与重组型毒株SAAS-SHNH及安徽分离株AH1401同源性也在99.5%以上；与疫苗株P1、国外分离株FM同源性则较低，其中VP基因仅为88.9%、89.3%。本试验结果表明近年国内的MDPV分离株同源性均较高，但仍存在一定程度的基因变异，增...     

犬细小病毒DD株的分离鉴定和VP2基因序列分析

本实验室对从疑似犬细小病毒感染的发病犬分离的病毒采用同步培养法接种猫肾细胞（CRFK）增殖,通过PCR试验、IFA试验和VP2基因测序分析等方法进行鉴定并分型,获得一株犬细小病毒强毒株,命名为CPV-DD株。对分离病毒进行PCR扩增,可扩增出特异性DNA片段（1 163 bp）;盲传至第6代时,病毒液的HA效价为1∶1...     

犬细小病毒黑龙江株(CPV-YN)的分离、鉴定及致弱的研究

为研制犬细小病毒(CPV)致弱疫苗,本研究通过将犬的组织样品接种CRFK细胞进行病毒分离,并对分离毒株进行了一系列鉴定。鉴定结果显示,分离的病毒在CRFK细胞上可产生明显的细胞病变(CPE),并且电镜下可以观察到典型的细小病毒粒子;HA效价可达到1∶256。回归动物试验显示该分离株可导致犬出现明显的CPV感染症状,PCR鉴定也进一步确定所分离的病毒为CPV(命名为CPV-YN株)。将CPV-YN株接种CRFK细胞连续传代至110代,在传代过程中,病毒的滴度逐渐提高,由初始的105.5 TCID50/0.1 mL逐渐增加到107.1 TCID50/0.1 mL。同时,CPV对犬的致病力逐渐降低。免疫效力试验结果表明,CPV-YNR可以对用同源强毒攻击的犬提供免疫保护作用,可作为理想的疫苗候选病毒株。     

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究鹅细小病毒(GPV)基因遗传变异特征,采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料,将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒,经PCR鉴定为鹅细小病毒,命名为HN株,并获得了其全基因组序列,将该序列与GenBank数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显示,该株病毒基因组全长为5 106bp,由ITR、NS、VP构成,其中ITR为444bp,NS1为1 844bp,VP1为2 199bp;HN株与SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分别达到99.8%和99.7%,与番鸭细小病毒株FM的NS1基因同源性最低,为82.7%;与90-0215株VP1同源性最低,为80.1%。HN株的遗传进化树可以看出,GPV可以分成明显的2个基因亚群,HN株与鹅细小病毒匈牙利株(B)、欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株(82-0321V、82-0321、06-0329)均处在第I亚群,且与安徽分离株Y株以及SHFX1201株同源性最接近,番鸭源匈牙利株FM单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了GPV的数据资料,为研究GPV分类地位以及遗传进化关系提供了依据,同时也为研究GPV流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。     

一株兔瘟病毒野毒株的分离与鉴定

为了对南部县某兔场疑似兔出血症病毒(RHDV)NB毒株进行鉴定,试验采用血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验、家兔接种试验、家兔免疫攻毒试验、VP60基因的同源性比对。结果显示:NB毒株能凝集人"O"型红细胞,HA效价为12 log2,其血凝性能被RHDV疫苗毒株AV33株的抗血清抑制;NB毒株注射健康非免家兔,家兔在48h内死亡,具有典型的兔病毒性出血症(RHD)的临床症状和病理变化;RHDV(AV33)组织灭活疫苗免疫家兔后,家兔能抵抗NB毒株的攻击;NB毒株与AV33毒株的VP60基因同源性为96.12%,氨基酸序列同源性为97.59%。     

贵阳地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为研究贵阳地区犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）的流行基因型及其遗传进化情况,本试验对从贵阳市分离的10株CPV的VP2基因进行PCR扩增和克隆并进行序列分析。结果显示,分离的病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变（CPE）,分离的10株病毒中,7株为CPV-2a亚型,3株为CPV-2c亚型,命名为GY-1~GY-10。10株CPV分离株与疫苗株VP2基因的同源性98.4%~99.4%,与其他国内外参考株的同源性为97.7%~99.9%。本试验首次报道贵阳市CPV的流行基因型为CPV-2a亚型并伴随CPV-2c亚型存在,对监测CPV遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。     

一株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定

为了解广东省猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株的基因变异及遗传演化的情况,本试验对广东佛山疑似暴发伪狂犬病的猪场采集的病料(脑、肺脏、扁桃体、肝脏、脾脏)进行了PCR鉴定,初步鉴定为PRV毒株后,将阳性病料接种非洲绿猴肾细胞(Vero),进行毒株传代培养,对分离毒株进行PCR检测及小鼠感染试验,证实该病毒为PRV,并命名为PRV FS-2015株;并对该毒株进行细胞病变观察、病毒TCID50测定、毒株gC和TK基因扩增及序列分析。结果显示,PRV FS-2015株TCID50为10-7.5/0.1mL。PRV FS-2015株的gC和TK基因序列与国内外PRV参考毒株进行同源性比对分析发现,其核苷酸序列同源性分别为95.8%~100.0%和99.4%~100.0%,氨基酸同源性分别为92.3%~100.0%和98.7%~100.0%。遗传进化分析表明,PRV FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ/YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系更近;但与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha、Yangsan、Min-A、SS和SL株的同源性较低,基因变异较大,表明PRV FS-2015毒株属于近几年流行的变异株。本研究结果可为广东省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

犬细小病毒新2b型分离株的分离鉴定

为了更好的了解我国东北地区犬细小病毒的流行情况,采用F81细胞从来自长春某宠物医院疑似患有肠炎的犬粪便样品中分离出1株病毒,经形态学、血清学、动物回归试验和分子生物学鉴定,分离的病毒为犬细小病毒new CPV-2b型,命名为CPV JL13-1。对该病毒主要结构蛋白VP2基因进行克隆测序和基因进化分析表明,CPV JL13-1分离株VP2基因与GenBank上提交的其他41株犬细小病毒株核苷酸和氨基酸均有较高的同源性,分别为98.6%~99.5%和97.6%~99.5%,其中核苷酸和氨基酸同源性最高的均为B-2004株。本研究为犬细小病毒分子流行病学调查和疫苗的研究奠定基础。