犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定

采集疑似细小病毒(CPV)感染犬的粪便,采用同步培养法接种胎猫肾细胞(F81)进行病毒分离鉴定。通过PCR检测、HA试验、IFA鉴定、电镜观察和空斑纯化,获得1株犬细小病毒,并命名为HZ0761。感染的F81细胞48h后出现明显的细胞病变;在病料和感染的F81细胞中均扩增出CPV VP2基因的特异性片段(221 bp);病毒液可凝集猪红细胞,血凝价为1∶28,其血凝性能被特异性抗体抑制;IFA可见特异性亮绿色荧光;电镜观察感染的F81细胞核内可见20 nm左右的病毒颗粒;病毒液的TCID50为10-4.8/mL,VP2基因序列分析显示该毒株为CPV-2 a型。     

犬细小病毒宁夏株的分离与鉴定

本试验采集宁夏地区疑似犬细小病毒感染病犬的粪便拭子,经过预处理后同步接种胎猫肾细胞(FK81),盲传3代后发现FK81细胞出现明显的细胞毒性改变(CPE)。冻融收获病毒后,对分离出来的病毒进行电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)检测、特异性PCR鉴定及VP2全基因序列扩增分析,成功分离培养出1株犬细小病毒(CPV)。     

犬细小病毒北京分离株的鉴定及其全基因组序列分析

首先对疑似犬细小病毒(CPV)感染的病犬粪便进行特异性PCR扩增,经目的片段测序分析,初步证明为CPV感染。将该病犬粪便处理物接种F81细胞,自第3代起,细胞出现典型CPE。对该株病毒进行电镜观察、理化特性试验、HA-HI及基因型等方面鉴定,证明该分离株为CPV,命名为CPV/BJ-L1株。该分离株的血凝效价为1∶512,其血凝性能被特异性抗体抑制;Reed-Muench法测定分离株病毒TCID_(50)为10-5.15/0.1 mL;电镜观察可见25nm左右的病毒颗粒;动物回归试验显示,攻毒犬能复制出CPV的典型临床症状和病理变化;对分离株的全基因组(包含两端完整的发夹结构序列)进行克隆、测序与分析。结果表明,BJ-L1为CPV-2a亚型,与GenBank中的21株CPV全基因序列核苷酸同源性为98.8%~99.8%,且与国内近期分离毒株高度同源。对2006-2014年北京市CPV分离株VP2基因进行序列分析,结果显示,CPV流行株的变异具有某种时间相关性。     

犬细小病毒CPV-SD03/19株的分离鉴定及遗传演化分析

为了解山东地区犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的生物学特性,阐明其基因组与遗传演化等特征,采集疑似感染CPV死亡犬的小肠,经PCR鉴定为CPV阳性,无菌处理病料后接种F81细胞进行病毒分离鉴定,通过电镜形态学观察及理化特性、血清学、分子生物学等试验进行验证。结果:成功鉴定、分离出1株CPV,命名为CPV-SD03/19株;电镜观察病毒粒子形态符合细小病毒形态特征;血凝试验效价为2;对NS基因和VP2基因进行序列比对与遗传进化树分析,结果显示CPV-SD03/19株抗原型为CPV-2a型,与CPV-LZ1株对比,在VP2基因上共有3处氨基酸发生非同义替换,分别为aa267(苯丙氨酸→酪氨酸)、aa426(天冬酰胺→赖氨酸)、aa440(苏氨酸→丙氨酸)。本研究对分析山东地区犬细小病毒的进化特征具有一定的参考价值。     

犬细小病毒CPV-BJ03/17株分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了研究当前犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)国内流行株的遗传变异情况,试验从北京某宠物基地采集疑似CPV感染死亡犬的肠道组织,无菌处理病料后,用F81细胞进行病毒培养,通过电镜形态学观察、血清学、分子生物学和攻毒试验进行鉴定。结果表明,病毒在F81细胞上出现明显的细胞病变(CPE),电镜观察可见直径20nm左右的病毒粒子,血凝效价1∶256,PCR鉴定在570bp处有特异性条带,证明分离出1株CPV,命名为CPV-BJ03/17。全基因组测序分析表明,病毒基因组全长4 620bp,提交GenBank,登录号为:MF134808;该毒株与广东(SC02/2011)、深圳(CPV-s5)和甘肃(CPV-LZ1)等地的分离株亲缘关系较近,核苷酸同源性均为99.7%。VP2氨基酸序列分析表明,CPV-BJ03/17分离株确定为New CPV-2a亚型,主要氨基酸位点与近期分离株BJ15-1等相比无明显变化。动物回归试验表明,CPV-BJ03/17为CPV强毒株。本研究分离出1株CPV强毒株,通过比较CPV的流行情况和遗传变异规律,为CPV的疾病治疗及疫苗研究提供参考。     

广东珠三角地区犬细小病毒分离与鉴定

为了解珠三角地区犬细小病毒(CPV)的流行情况及研制有效的疫苗,本研究开展了CPV流行病学调查,并将32份疑似CPV感染犬的粪便样品处理后接种F81细胞进行病毒分离,并对分离株进行鉴定。鉴定结果显示:32份样品中有19份样品提取液在F81细胞上可以产生明显的细胞病变;HA效价可达到1∶256。回归动物试验显示分离株可以导致犬出现明显的CPV感染症状,PCR鉴定也进一步确定所分离的病毒为CPV。通过VP2基因同源性分析显示分离株与国内主要的流行基因亚型CPV-2a的同源性达98%以上。     

犬细小病毒病诊断技术国家标准

1范围本标准规定了犬细小病毒病的临床检查、血凝与血凝抑制试验、PCR检测的操作方法。本标准适用于犬细小病毒病的鉴定及其流行学调查、诊断和监测。其中病毒分离、血凝与血凝抑制试验、PCR检测适用于犬细小病毒的病原诊断。2试剂和材料2.1FK81细胞(猫肾细胞)。     

犬细小病毒CPV-BJ03/17株分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了研究当前犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）国内流行株的遗传变异情况,试验从北京某宠物基地采集疑似CPV感染死亡犬的肠道组织,无菌处理病料后,用F81细胞进行病毒培养,通过电镜形态学观察、血清学、分子生物学和攻毒试验进行鉴定。结果表明,病毒在F81细胞上出现明显的细胞病变（CPE）,电镜观察可见直径20 nm左右的病毒粒子,血凝效价1：256,PCR鉴定在570 bp处有特异性条带,证明分离出1株CPV,命名为CPV-BJ03/17。全基因组测序分析表明,病毒基因组全长4 620 bp,提交GenBank,登录号为：MF134808;该毒株与广东（SC02/2011）、深圳（CPV-s5）和甘肃（CPV-LZ1）等地的分离株亲缘关系较近,核苷酸同源性均为99.7%。VP2氨基酸序列分析表明,CPV-BJ03/17分离株确定为New CPV-2a亚型,主要氨基酸位点与近期分离株BJ15-1等相比无明显变化。动物回归试验表明,CPV-BJ03/17为CPV强毒株。本研究分离出1株CPV强毒株,通过比较CPV的流行情况和遗传变异规律,为CPV的疾病治疗及疫苗研究提供参考。     

犬细小病毒四川株的分离鉴定与一步生长曲线的测定

为研究犬细小病毒(CPV)生长规律,利用F81细胞从四川地区疑似CPV感染的病犬血样粪便中分离得到1株CPV,对该株病毒进行理化试验、微量中和试验、PCR鉴定以及分子生物学系统鉴定后,证实该分离株是CPV,命名为SC-C。以SC-C分离株感染F81细胞,感染后不同时间收取上清,利用CPV荧光定量PCR检测方法对不同样品中病毒DNA进行定量分析,绘制CPV一步生长曲线。结果显示,感染后,0⁸h细胞内病毒DNA含量较低,感染8h后,细胞内病毒DNA含量逐渐增长,128h细胞内病毒DNA含量较低,感染8h后,细胞内病毒DNA含量逐渐增长,12⁶0h细胞内病毒DNA含量迅速增长,60h后细胞内病毒DNA含量变化不大。CPV感染F81细胞,感染后060h细胞内病毒DNA含量迅速增长,60h后细胞内病毒DNA含量变化不大。CPV感染F81细胞,感染后0¹2h为潜伏期,病毒DNA含量维持在较低水平;1212h为潜伏期,病毒DNA含量维持在较低水平;12⁶0h为突破期,病毒DNA含量呈对数增长;感染60h后增长速度减缓,病毒含量维持在较高水平逐步进入稳定期,病毒DNA含量呈"S型"曲线增长。     

犬细小病毒黑龙江流行株的分离鉴定及其VP2基因的遗传进化分析

为了解黑龙江省犬细小病毒(CPV)的流行情况,本研究从黑龙江省哈尔滨市、双城市、鹤岗市和大庆市的宠物医院共收集了 10份经胶体金拭子检测为CPV阳性的犬粪便样品,利用F81细胞进行病毒的分离,并对分离的病毒进行PCR、血凝性试验、病毒分型鉴定和VP2基因的遗传进化分析.结果显示,有8份处理后的病料样品接种猫肾细胞F81...     

犬细小病毒YZ分离株的鉴定

对1999年冬季江苏省实验动物Beagle犬基地暴发的以拉稀、便血、高死亡率的病犬作流行病学调查、病理和实验室诊断。粪便血凝价高达2^14以上，并用HI加以验证，初步诊断为犬细小病毒感染引起的出血性肠炎。用FK81细胞（胎猎肾传代细胞）分离病毒，细胞上清HA试验阳性；负染电镜观察到在小为20nm左右的病毒粒子；接种病料的细胞IFA检测可见特异性的亮绿色荧光。在小肠的病理切片中见到典型的嗜酸性核内包涵体。以此确诊为犬细小病毒感染引起的出血性肠炎。利用双琼脂空斑技术克隆一株犬细小病毒，命名为CPV－YZ株，其核酸型是单链DNA，对甲醛敏感，对氯仿、酸、胰蛋白酶不敏感，80℃ 60分钟失去活力，0．1ml TCID50是10^-6.8,SDS-PAGE电泳两条清晰的条带分别为：76kD的VP1，64kD的VP2。     

犬用细小病毒自然弱毒株的分离、鉴定和免疫研究

应用猫肾传代细胞F81系,以同步接毒和带毒传代的方法。先后从50份犬、15份狐、75份貉和8份狮、虎、豹病料中分碍15株犬细小病毒(cpv)、3株貉细小病毒和6株猫泛白细胞减少症病毒,未分到狐细小病毒。通过人工感染试验,从中挑选到1株对犬和本动物无致病性、但具有良好免疫原性的细小病毒——貉细小病毒CR86106株。经核酸型、形态学、理化学、生物学特性试验以及与CPV核酸酶切图比较试验等系统鉴定,CR86106株病毒为1株与CPV特性基本相同,但也存在有一定差别的小DNA病毒。免疫试验和田间试验证明,CR86106株病毒遗传性稳定;对母源抗体干扰具有较强的抵抗力;免疫接种犬虽可随粪便排出少量原接种病毒,但不会使同居犬感染发病;试验犬经两次疫苗接种后攻毒,可获得完全保护,且不会随粪便排出强毒。累计免疫军、警犬3320只,全部安全,保护率达99.28％。     

分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

为制备犬细小病毒(CPV)单克隆抗体,用F81细胞繁殖CPV,病毒液经二乙烯亚胺(BEI)灭活、纯化后免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经筛选获得2株分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为F1和B6.F1和B6分泌的单克隆抗体Ig亚类均为IgG1;以F1和B6制备的腹水,经检测,间接ELISA效价均为1×105,免疫荧光效价分别为1:3200和1∶6400;F1和B6培养上清的抗体中和效价分别为1∶1024和1∶2048,血凝抑制效价分别为1∶2048和1∶4096;免疫印迹(Western-blotting)和抗原表位分析结果显示,F1和B6分泌的单克隆抗体可能分别针对CPV的空间表位和线性表位.2株分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立可进一步用于开发CPV特异性诊断制剂和治疗制剂.     

犬细小病毒的分离鉴定

用猫肾(F81)细胞从沈阳某养犬场病死犬的肠内容物中,分离到1株细小病毒.根据犬细小病毒(CPV)VP2基因的核苷酸序列设计合成了两对特异性引物,对分离的病毒株进行PCR扩增,分别得到846 bp和815 bp的2个片段,PCR产物经纯化后测序,测序结果与GenBank中已发表的CPV参考株PLI-IV(typeFPV)、CPV-b(type2)、V154(type2a)、LCPV-V204(type2b)、LCPV-V139(type2c(a))和LCPV-V203(type2c(b))的VP2基因序列相比较,根据分析比较的数据结果,确定此株细小病毒为CPV-2a亚型.     

犬细小病毒PCR诊断方法的建立及对大熊猫粪便的检测

根据GenBank中登录的犬细小病毒(CPV) VP2基因序列,设计合成1对特异性引物;以CPV疫苗株为模板,建立了一种快速检测CPV的PCR检测方法,并应用于CPV诊断.结果显示,以此对引物进行PCR扩增能得到与理论设计值大小一致的342 bp的特异性条带,对犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)、新城疫病毒(NDV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPV)扩增结果均为阴性;最低可检出约1.4 pg的病毒核酸;重复性试验结果表明,其检测重复性好;对45份临床宠物犬病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测拭纸捡测结果进行比较,吻合率为90.0％.将此方法初步应用于大熊猫粪便中细小病毒的检测,结果表明,从熊猫基地采集的52份正常大熊猫粪便样品中有8份为细小病毒阳性,阳性率为15.3％.大熊猫是通过自然感染还是弱毒苗感染细小病毒的机制还不清楚.     

犬细小病毒分离鉴定及其基因型调查的基础研究

用F81细胞从不同地区送检的25份肠炎犬病料中分离出10株细小病毒，经形态学，理化学，生物学和分子病毒学等鉴定，结果这10株病毒均能在F81细胞上生长，产生细胞肿胀、变圆、破碎、脱落等细胞病变；病毒粒子呈立体对称，直径为20～24nm，无囊膜，抗氯仿，耐酸，耐热，能被5-IUDR抑制，可凝集猪、马、猫的红细胞，不能凝集人、鸡、豚鼠、兔的红细胞，HA试验能被抗CPV的特异性抗体所抑制，用犬细小病毒（CPV）特异性引物对10株病毒进行PCR扩增，结果扩增片段与阳性对照大小一致(771bp），用PV/犬/JL/1/02、PV/犬/BJ/1/99和PV/犬/GZ/1/02三个毒株进行人工感染犬试验，结果人工感染犬在接种后白细胞总数出现短期不同程度的下降，在攻毒后4～14d粪便PCR检查阳性，其中接种PV/犬/BJ/1/99的一只犬出现严重的肠炎症状并死亡，其余接种犬没有出现明显的临床症状，但血清抗体均升高（大于5倍），而对照组的白细胞总数和血清抗体没有明显的变化，粪便PCR检测阴性，表明所分离毒株能够感染犬，鉴定结果证明，CPV在我国犬群中仍广泛存在。     

犬细小病毒黑龙江株(CPV-YN)的分离、鉴定及致弱的研究

为研制犬细小病毒(CPV)致弱疫苗,本研究通过将犬的组织样品接种CRFK细胞进行病毒分离,并对分离毒株进行了一系列鉴定。鉴定结果显示,分离的病毒在CRFK细胞上可产生明显的细胞病变(CPE),并且电镜下可以观察到典型的细小病毒粒子;HA效价可达到1∶256。回归动物试验显示该分离株可导致犬出现明显的CPV感染症状,PCR鉴定也进一步确定所分离的病毒为CPV(命名为CPV-YN株)。将CPV-YN株接种CRFK细胞连续传代至110代,在传代过程中,病毒的滴度逐渐提高,由初始的105.5 TCID50/0.1 mL逐渐增加到107.1 TCID50/0.1 mL。同时,CPV对犬的致病力逐渐降低。免疫效力试验结果表明,CPV-YNR可以对用同源强毒攻击的犬提供免疫保护作用,可作为理想的疫苗候选病毒株。     

犬细小病毒CPV-YH毒株的分离鉴定及其基因组变异分析

为分析当前犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)基因组遗传变异情况,本研究从细小病毒阳性患犬粪便中分离到一株病毒,经过病毒的形态学观察、血凝试验、动物回归试验以及分子生物学鉴定,分离的病毒确实为犬细小病毒,并命名为CPV-YH。病毒分离结果显示,病料接种A-72细胞能产生典型的细胞病变,病毒能凝集猪红细胞,在电子显微镜下呈圆形或六边形,无囊膜,直径约为20nm。动物回归试验复制出了犬细小病毒病典型症状:出血性肠炎、肝水肿、肺淤血。全基因组序列测定与分析显示,其基因组全长为4 921nt,与2011年兰州分离的CPV-LZ2分离株基因组相似性最高,为99%;VP2氨基酸进化树显示,CPV-YH分离株与2013-BJ-P27(中国)分离株和UY306(乌拉圭)分离株在同一个小的分支上。与GenBank上收录的CPV代表株的VP2基因比对,核苷酸和氨基酸相似性分别是98%~99.4%和97.1%~99.5%。以上试验结果表明,成功分离一株CPV变异株,这些数据将为CPV的流行情况和防控提供基础。     

犬细小病毒单克隆抗体的制备及其在胶体金免疫层析试纸研发中的应用

为制备犬细小病毒胶体金免疫层析试纸,将F81细胞中分离的CPV免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立间接ELISA方法筛选分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞,获得1株能稳定分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E2。3E2的亚类为IgG1型,腹水抗体效价为1.8×105,交叉试验表明,3E2可与CPV特异性结合,与其他犬常见病毒无交叉反应。用3E2单克隆抗体制备的检测CPV的胶体金免疫层析试纸条特异性良好,为诊断和研究CPV奠定了基础。     

凌源县犬病毒病的调查

在凌源地区五个品种的犬中,德国黑背犬的发病率最高.达65.3%;2～3月龄幼犬发病率(82.6%)高于其它年龄组的犬.抽样检查的11份样品,有10份血清为犬细小病毒(CPV)血凝抑制抗体阳性;10份粪便的CPV血凝阳性或疑似阳性,经电镜观察见有典型的细小病毒和冠状病毒颗粒,1份脏器样品见有典型犬瘟热病毒。从2份粪便样品中分离出CPV.