腐蹄病C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与表达载体的构建

用PCR技术从腐蹄病C型节瘤拟杆菌克隆出具有免疫保护性抗原0.85kb纤毛蛋白基因（pili基因），利用该基因构建了纤毛蛋白基因表达载体。提取C型节瘤拟杆菌染色体DNA；用所设计的专一性引物进行PCR，扩增出pili基因；将pili基因克隆于TE载体，TE－pili重组质粒pili基因序列测定结果正确，用EcoRI酶切，低熔点胶回收pili基因片段，经klenow补平后，用T4DNA连接酶将其与中间载体pPLλ连接，将pili基因克隆于pPLλ载体，经BamHI、BamHI HindⅢ、Dral酶切鉴定pili基因正向插入pPLλ载体；扩增pPLλ-pili重组质粒，用BamHI酶切出2.1kb大小片段，回收后，与PME290表达质粒连接，转化宿主细胞PAK／2pfs中，对获得的重组质粒用BamHI酶切，出现2.1kb大小的带,证明含有目的基因。     

应用Gibson Assembly方法构建狂犬病病毒SRV9株重组感染性cDNA克隆

应用Gibson Assembly连接法精确快速构建狂犬病病毒SRV9株重组感染性cDNA克隆,为狂犬病病毒感染性cDNA克隆的构建提供新的方法。应用Gibson Assembly连接法在同一反应体系内,将多个片段和经限制性内切酶线性化的载体,按设计的顺序进行连接,实现多个片段的一步组装。设计带有20bp~30bp重叠序列的PCR引物,扩增得到带有重叠序列的狂犬病病毒5个结构蛋白基因和增强型荧光蛋白基因。扩增的片段和线性化的载体经胶回收纯化后,与Gibson连接液混合后,50℃反应60min,连接产物转化Stbl3感受态细胞,提取重组质粒,经PCR、酶切和测序鉴定,缺失了病毒伪基因Ψ区和糖蛋白基因的跨膜区并且将增强型荧光蛋白基因插入糖蛋白基因终止密码子前,构建了全长17 600bp的重组质粒,完成了重组全长感染性cDNA克隆的构建。     

SREBP-1c基因重组腺病毒的构建及其在犊牛原代肝细胞中的表达

将携带有化学合成的SREBP-1c基因的质粒先用Xba Ⅰ酶切,Klenow补平突出末端,纯化回收后再用Hind Ⅲ酶切,切胶回收目的基因片段;并将其克隆至用EcoR Ⅴ/HindⅢ酶切回收的pShuttle-EGFP-CMV(-)TEMP穿梭载体上.经酶切鉴定后,重组穿梭质粒和腺病毒pAdxsi质粒分别用I-Ceu Ⅰ+I-Sce Ⅰ双酶切处理,T4DNA连接酶连接,获得重组质粒pAdxsi-GFP-SREBP1c,酶切鉴定后经Pac Ⅰ酶切线性化转染HEK293细胞,经包装扩增后用TCID50测定病毒滴度.以重组腺病毒感染犊牛原代肝细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中SREBP1c mRNA和蛋白的表达量.结果显示,重组腺病毒酶切鉴定正确,滴度可达1.2×1010,腺病毒感染犊牛原代肝细胞中SREBP-1c mRNA和蛋白的表达显著升高.结果表明,本试验成功构建了SREBP-1c基因过表达重组腺病毒,且SREBP-1c在犊牛原代肝细胞中高度表达.     

广西巴马小型猪TXNIP基因真核表达载体的构建及鉴定

为了克隆广西巴马小型猪硫氧还蛋白相互作用蛋白基因(TXNIP)序列并构建真核表达载体,为生产转TXNIP基因的广西巴马小型猪奠定基础,试验采用RT-PCR技术从广西巴马小型猪胰腺组织中扩增出TXNIP基因编码序列,连接至p MD18-T载体,测序鉴定后提取质粒,用SalⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切,回收的TXNIP片段连接至p EGFP-C1载体上,构建含TXNIP的真核表达载体p EGFP-C1-TXNIP;利用双酶切和测序对重组质粒p EGFP-C1-TXNIP进行鉴定,并将重组质粒转染β-TC6细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。结果表明:广西巴马小型猪TXNIP基因编码区序列长1 176 bp,编码391个氨基酸,与Gen Bank已公布的猪TXNIP基因c DNA序列(序列号为DQ278874)对应区段同源性为99.7%;重组表达载体p EGFP-C1-TXNIP质粒转染β-TC6细胞能表现出绿色荧光。     

猪肠黏膜保护因子HO-1的短小芽孢杆菌表达系统建立与分析

【目的】 对猪黏膜保护因子——血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）基因进行克隆及原核表达，为研究高表达HO-1在肠黏膜损伤中的保护作用提供技术支持。【方法】 根据GenBank中公布的HO-1序列（登录号：NM_001004027.1），利用Primer Premier 6.0设计1对特异性引物，利用RT-PCR方法扩增HO-1基因片段，将其与pMD19-T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行PCR鉴定；将载体pNCMO2与重组载体pMD19-T-HO-1进行Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切，使用T4 DNA连接酶连接，利用电击转化技术将重组表达载体pNCMO2-HO-1转入感受态短小芽孢杆菌，使用IPTG进行诱导表达，应用SDS-PAGE和Western blotting分析HO-1在短小芽孢杆菌中的融合表达情况。【结果】 猪HO-1基因全长897 bp，编码298个氨基酸。双酶切后在约5 200和897 bp处分别观察到pNCMO2载体片段和HO-1基因片段，证明成功构建基因表达载体pNCMO2-HO-1；电转后的双酶切结果表明，在相同的位置观察到pNCMO2和HO-1片段，证明重组表达载体pNCMO2-HO-1成功导入短小芽孢杆菌。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果发现，在36.5 ku处出现了明显的蛋白印迹，表明成功表达了HO-1的重组蛋白，且为胞外分泌。【结论】 本研究成功构建了HO-1的重组原核表达载体，pNCMO2-HO-1重组载体可以在短小芽孢杆菌中诱导表达。     

猪瘟病毒NS4B真核表达载体的构建与表达

猪瘟病毒NS4B蛋白是猪瘟病毒编码的一个非结构蛋白,由347个氨基酸残基组成。NS4B在病毒中可能与致细胞病变有关,具体功能尚不清楚。本试验利用PCR扩增NS4B基因,利用双酶切、连接和转化等操作方法,与质粒载体p EGFP-N3构建成真核表达重组质粒,双酶切检测猪瘟病毒NS4B真核表达载体构建成功。测定重组质粒序列,并验证表达成功,为今后的功能研究奠定了基础。     

线粒体DNA缺失质粒pMDD-Z的构建及鉴定

分别以pEGFP-Mito和pAN4质粒为模板,扩增出MTS-EGFP和EcoRⅠ基因片段,利用快速体外基因重组技术-重组PCR,将两者连接得到MTS-EGFP-EcoRⅠ片段,构建克隆载体pTRE2hyg-EE,经AgeⅠ和NotⅠ双酶切得到MTS-EGFP-EcoRⅠ融合基因产物,连接克隆于真核表达质粒pEGFP-Mito后获得pMDD-Z质粒。琼脂糖凝胶电泳结果显示,MTSEGFP和EcoRⅠ基因片段大小分别是831 bp和860 bp。测序结果显示,插入pTRE2hyg--EE克隆载体中的MTS-EGFPEcoRⅠ片段大小1 672 bp,且基因序列正确,没发生点突变。琼脂糖凝胶电泳结果显示,pMDD-Z质粒的双酶切产物分别为1 587 bp的插入片段和4 024 bp的载体片段。测序结果显示,pMDD-Z质粒中含1 659 bp的开放阅读框,编码553个氨基酸,从N端至C端,分别为线粒体信号导肽、绿色荧光蛋白和限制性内切酶EcoRⅠ,且未发生移码突变。     

犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建

根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。     

犬瘟热病毒GZ-Z株H基因原核表达载体的构建

利用实验室构建的含有犬瘟热病毒H基因的p MD18-H质粒,根据其序列设计带有Bam HⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,对H基因ORF进行PCR扩增,得到约1 949 bp的片段。将该片段克隆到p MD18-T载体内,用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定、质粒PCR鉴定,筛选出阳性克隆。将阳性克隆再用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切,纯化回收CDV H基因ORF片段;将原核表达载体p ET32a(+)用同样的方法酶切,回收载体片段,并用T4连接酶将以上两回收片段连接,构建原核表达载体质粒p ET32-H,后经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切、质粒PCR、测序进行系列鉴定。结果表明,p ET32-H原核表达质粒构建成功,其中插入片段大小为1 842 bp,可编码607个氨基酸残基。该实验为下一步H蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定了基础。     

轮状病毒VP4基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从轮状病毒感染的细胞中扩增了816bp的VP4片段中抗原表位区.通过T4 DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-V4中含有轮状病毒的VP4基因片段.经核苷酸序列分析,表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4基因中抗原表位区.     

家兔Ⅰ型肽载体(PepTⅠ)基因的克隆与原核表达

用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。     

奶牛MC4R基因真核表达载体的构建及其表达定位

奶牛黑素皮质素受体-4(MC4R)基因作为G蛋白偶联受体,是关系经济性状的重要候选基因。本研究从牛基因组中克隆得到MC4R基因的编码序列,将克隆片段与pc DNA3.1真核表达载体进行KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接形成重组表达载体,将载体瞬时转染到L02肝脏细胞,采用免疫荧光对细胞进行标记,通过激光共聚焦显微镜观察荧光活性,结果发现克隆的MC4R基因序列长度大约1 000 bp,成功构建真核表达载体MC4R-3.1,将载体转染肝脏细胞后Western blot检测蛋白表达,经过激光共聚焦观察荧光后发现MC4R蛋白的绿色荧光在细胞膜上有正常表达,可为进一步研究MC4R受体基因功能提供参考。     

绵羊白细胞介素2基因的克隆与表达载体构建

从绵羊血中分离白细胞,提取绵羊白细胞RNA,利用RT-PCR、PCR扩增绵羊白细胞介素2(OvineIL-2)基因。将OvineIL-2PCR产物与TE载体定向连接,用SaLI和BamHI双酶切重组TE,利用低溶点胶回收500bp大小的片段;将其补平后与PPSD质粒连接,用EcoRI酶切鉴定,找出正向连接重组质粒。用BamHI酶切重组PPSD质粒,低熔点胶回收2500bp大小的片段;将其与经BamHI酶切去磷酸化的PME290表达质粒连接,筛选出阳性重组PME290,即为OvineIL-2基因表达载体。     

表达α-烯醇化酶重组腺病毒的构建及其在籽鹅卵泡颗粒细胞中的过表达

为构建表达籽鹅α-烯醇化酶(ENO1)基因的重组腺病毒,本研究利用RT-PCR技术,从籽鹅卵巢组织中扩增ENO1基因,克隆至pShuttle-CMV穿梭载体中,并利用I-CeuI与I-SceI将ENO1基因的表达框切下,连接到腺病毒骨架的pAdxsi载体中。采用PacⅠ酶切,将其线性化,并转染至293(R)细胞进行病毒的包装,制备重组腺病毒。实验结果显示,制备的表达ENO1重组腺病毒的滴度达到1.1×1011pfu/mL。将重组腺病毒感染籽鹅卵泡颗粒细胞后,荧光定量RT-PCR与western blot检测显示细胞中ENO1基因和蛋白表达水平显著高于正常细胞(p<0.05),这些结果为研究ENO1生物学活性及功能奠定了基础。     

轮状病毒VP4基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增了816bp的VP4片段中抗原表位区。通过T4 DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5a中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定，证明重组质粒pT-4中含有轮状病毒的VP4基因片段。经核苷酸序列分析，表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4基因中抗原表位区。     

长白山梅花鹿鹿茸干细胞S100A4基因克隆及原核表达

为了研究S100A4蛋白在鹿茸发生过程中的生物学功能,构建长白山梅花鹿鹿茸S100A4基因原核表达载体,并进行BL21原核表达;自鹿茸骨膜中提取总RNA,逆转录成c DNA,以特异性引物扩增S100A4,扩增产物克隆到p MD18-T载体并测序鉴定,将目的片段和原核表达质粒p ET-15b分别用Bam H I和HindⅢ双酶切并连接,再将重组质粒转入BL21用TPIG进行诱导表达;结果通过序列的对比分析,S100A4基因是一个相对保守的基因,与多个物种的匹配度达到90%,与牛S100A4基因同源性最高,达到98.4%;成功构建了p ET15b-S100A4表达质粒,转化BL21诱导表达后,SDS-PAGE电泳检测显示表达的蛋白分子量为11 k D,与预期一致。表明梅花鹿鹿茸干细胞S100A4基因的可以在原核中克隆、分析和表达,为真核表达和进一步的蛋白功能分析奠定了基础。     

新型鸭腺病毒4型Fiber2蛋白的表达

Fiber2是鸭腺病毒4型（DAdV-4）的主要结构蛋白和免疫原性蛋白。本研究以DAdV-4毒株DNA为模板进行PCR扩增Fiber2基因片段，转化DH5a，通过EcoR I和Hind III酶切后与p ET28α载体通过T4 DNA连接酶进行连接，构建重组表达载体，经序列测序鉴定后转化BL21(DE3)构建重组表达菌，利用IPTG诱导表达Fiber2重组蛋白，经用SDS-PAGE电泳检测，结果显示，Fiber2重组蛋白能在大肠杆菌以包涵体形式表达。上述研究为鸭腺病毒4型的防控提供物质基础。     

人补体膜辅助调节蛋白(MCP)基因的克隆和序列分析

应用 PCR方法 ,从成人肝 c DNA文库中扩增编码人补体膜辅助调节蛋白 (MCP)分子的 c DNA片段。该片段经双酶切后克隆于 p UC19载体中 ,并测定其序列。序列分析表明 ,该 c DNA长 112 2 bp,编码 36 9氨基酸残基组成的蛋白 ,属于 STC CYT2亚型。     

可定点整合的无筛选标记拟蛛丝蛋白基因表达载体的构建与鉴定

为了构建可定点整合的无筛选标记的拟蛛丝蛋白基因表达载体,试验以p EGFP-N1为骨架载体,并采用PCR技术分别添加Loxp和att B片段,利用无缝克隆法将拟蛛丝蛋白基因(2s)连入质粒,经过转化、阳性克隆筛选、酶切及DNA测序鉴定。结果表明:PCR产物及酶切片段大小符合预期结果,测序结果与相应寡核苷酸序列一致。说明试验成功构建了可定点整合的无筛选标记拟蛛丝蛋白基因表达载体p EGFP-N1-2s,可用于无筛选标记的转基因供体细胞的构建。