芦丁对围产期湖羊瘤胃发酵、瘤胃菌群结构及抗氧化性能的影响

旨在研究饲粮中添加芦丁对围产期湖羊瘤胃发酵、瘤胃菌群结构及抗氧化性能的影响。选择30只围产期相近、体重[(62.90±2.80) kg]相似的24月龄围产期湖羊，随机分为3组，每组10个重复。芦丁在基础饲粮中的添加剂量分别为0 mg·kg^-1 BW(CON组)、50 mg·kg^-1 BW(Ⅰ组)和100 mg·kg^-1 BW(Ⅱ组)。预试期7 d,正式试验期56 d。产后28 d晨饲前，每组随机选取5只羊屠宰，检测瘤胃组织形态、瘤胃发酵参数、抗氧化性能及瘤胃菌群结构。结果发现：1)各组围产期湖羊日粗饲料采食量、日干物质采食量和日中性洗涤纤维采食量差异均不显著(P>0.05);2个试验组围产期湖羊的产后体重、末体重(FBW)和平均日增重(ADG)均高于CON组，但差异不显著(P>0.05),各组产羔数量及羔羊体重无显著变化(P>0.05);2)Ⅱ组围产期湖羊瘤胃乳头长度显著高于CON组(P<0.05);3)Ⅰ组瘤胃液中谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性显著高于CON组(P&l...     

SREBP-1c基因重组腺病毒的构建及其在犊牛原代肝细胞中的表达

将携带有化学合成的SREBP-1c基因的质粒先用Xba Ⅰ酶切,Klenow补平突出末端,纯化回收后再用Hind Ⅲ酶切,切胶回收目的基因片段;并将其克隆至用EcoR Ⅴ/HindⅢ酶切回收的pShuttle-EGFP-CMV(-)TEMP穿梭载体上.经酶切鉴定后,重组穿梭质粒和腺病毒pAdxsi质粒分别用I-Ceu Ⅰ+I-Sce Ⅰ双酶切处理,T4DNA连接酶连接,获得重组质粒pAdxsi-GFP-SREBP1c,酶切鉴定后经Pac Ⅰ酶切线性化转染HEK293细胞,经包装扩增后用TCID50测定病毒滴度.以重组腺病毒感染犊牛原代肝细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中SREBP1c mRNA和蛋白的表达量.结果显示,重组腺病毒酶切鉴定正确,滴度可达1.2×1010,腺病毒感染犊牛原代肝细胞中SREBP-1c mRNA和蛋白的表达显著升高.结果表明,本试验成功构建了SREBP-1c基因过表达重组腺病毒,且SREBP-1c在犊牛原代肝细胞中高度表达.     

黄曲霉毒素B1间接竞争化学发光酶免疫分析方法的建立

本试验建立了一种用于检测玉米中黄曲霉毒素B1的间接竞争化学发光酶免疫分析方法.以辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢-对碘苯酚作为发光体系,通过对包被抗原、检测抗体和酶标二抗浓度的优化建立其标准曲线.所建方法的线性范围为0.31～20 μg/L,相关系数R2=0.992 7,灵敏度为0.09μg/L,处理内和处理间变异系数分别小于9.79％和13.08％,样品加标回收率为70.3％～100.85％.采用所建立的方法对10份玉米样品进行检测,检测结果与进口ELISA试剂盒的相关系数为0.831.结果表明本研究所建的方法可用于实际样品的检测.     

p38介导β-羟丁酸对原代培养犊牛肝细胞凋亡的影响

本试验旨在探讨β-羟丁酸（BHBA）对体外原代培养犊牛肝细胞凋亡的影响以及p38MAPK在其中的调控作用。选择培养72h的肝细胞,添加不同浓度的BHBA（0、0．6、1．2、2．4mmol／L）,培养9h,每个浓度3个重复。另外选取细胞,p38MAPK抑制剂SB203580（10pmol／L）预处理1h后,添加BHBA,使其终浓度为2．4retool／L;PI／An—nexinV—FITC双染,运用荧光显微镜观察肝细胞凋亡情况;ELISA法检测p38的活性;实时荧光定量PCR方法检测p38、Caspase-3、Caspase9、bcl2基因的mRNA表达水平。结果表明,与对照组相比,1．2和2．4mmol／I—BHBA组的肝细胞凋亡明显增加;p38酶活性明显升高;p38、caspase-3和caspase-9基因mRNA表达水平均显著增加（P〈0．01）。bcl2基因mRNA表达水平显著降低（P〈0．05）;添加p38抑制剂后,caspase-3和caspase-9基因mRNA表达水平显著降低（P〈0．01）,bcl-2基因mRNA表达水平显著增加（P〈O．05）。高浓度的BHBA可以诱导体外原代培养犊牛肝细胞凋亡,p38在BHBA诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。     

非酯化脂肪酸对体外培养犊牛原代肝细胞中炎性因子表达及其活性的影响

在建立犊牛原代肝细胞体外培养模型的基础上，通过培养液中添加不同浓度的非酯化脂肪酸（Nonesterifiedfatty acids，NEFAs），运用实时荧光定量PCR和ELISA方法，测定NEFAs对肝细胞中炎性因子TNFα、IL-6和IL-1β的mRNA表达及其活性的影响。结果显示，NEFAs作用肝细胞9h后，与对照组相比，高浓度NEFAs（1．8mmol／L）组肝细胞中TNFα、IL-1β的mRNA表达水平显著增加（P〈0．05），IL-6的mRNA表达水平在2．4retool／L时极显著增加（P〈0．01），低浓度NEFAs（0．6、1．2mmol／L）组肝细胞中TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平无显著差异（P〉0．05）；并且TNFα、IL-1G的活性在NEFAs浓度达到1．8、2．4mmol／L显著高于对照组（P〈0．01），且呈剂量依赖性作用，IL-6的活性在在NEFAs浓度达到1．8mmol／L显著高于对照组（P〈0．01），在2．4mmol／L也高于对照组，但差异不显著。结果表明，高浓度NEFAs在-定程度上能引起或加剧奶牛肝细胞炎性反应，可能是导致产后奶牛肝功能炎性损伤主要因素。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养犊牛肝细胞CPT-Ⅰ和CPT-ⅡmRNA表达的影响

体外原代培养犊牛肝细胞,添加不同浓度的胰岛素（insulin,INS）（0、1、10、100、1 000nmol/L）和胰高血糖素（glucagon,GLN）（0、1、10、100、1 000nmol/L）,每个处理做3个重复,分别培养1h后,提取总RNA。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法,检测肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅰ）和肉碱棕榈酸转移酶Ⅱ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅱ）mRNA表达的变化。结果显示,随着培养液中INS含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量逐渐降低,呈现一定的剂量依赖性。随着培养液中GLN含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量均升高,呈现一定的剂量依赖性,且当GLN的添加浓度高于100nmol/L时,CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量显著升高（P〈0.01）。结果表明,INS可在一定程度上抑制脂氧化关键酶的表达,GLN可显著促进脂氧化关键酶的表达。     

玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA检测方法的初步建立

为了研究玉米赤霉烯酮的间接竞争ELISA检测方法,试验采用牛血清白蛋白与玉米赤霉烯酮的耦联物(ZEN-BSA)做包被抗原,标准玉米赤霉烯酮(ZEN)做竞争抗原,以制备的可稳定分泌抗ZEN的单克隆抗体为基础,初步建立了ZEN间接竞争ELISA检测方法。结果表明:间接竞争ELISA检测方法线性范围为0.363 2～78.985 2μg/L,最低检测限为0.231 9μg/L;曲线回归方程为y=68.711-25.666x,其中R2=0.987 1,批内平均变异系数为3.10%,批间平均变异系数为6.26%,与相似毒素的交叉反应率均小于0.01%。说明建立的检测方法可以用于ZEN的检测。     

腺苷酸活化蛋白激酶信号转导通路在奶牛酮病发生和发展过程中的调控机制

奶牛酮病是围产期奶牛常见的营养代谢性疾病,给奶牛业造成了巨大的损失。奶牛酮病发生时,相关的能量代谢激素也发生了明显的变化,主要是胰高血糖素和胰岛素。腺苷酸活化蛋白激酶被认为是机体的能量感受器,一些能量代谢激素可以引起其活性的变化。本文就胰高血糖素和胰岛素对腺苷酸活化蛋白激酶信号转导通路发生作用机制做一论述,旨在为下一步研究奶牛酮病提供理论支持。     

奶牛载脂蛋白B100基因克隆及原核表达

本研究根据GenBank已收录奶牛ApoB100基因序列,设计特异性引物获得目的基因。经pGM-T载体克隆,对重组质粒进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定并测序,序列同源性达100%;将目的基因连接到pET-28a表达载体中,提取质粒,转化到Rosetta(DE3)中,筛选的阳性克隆经IPTG诱导。SDS-PAGE初步分析表明,成功获得分子质量为35 ku的蛋白质;Western blotting结果呈阳性,表明通过本试验成功获得了目的蛋白。