NEFA BHBA对体外培养牛肝细胞的HP和SAA mRNA表达的影响

为了验证奶牛酮病发病过程中机体会产生大量的NEFA(非酯化脂肪酸)、BHBA(β-羟丁酸)可能是脂类代谢关键的调节因素。本试验通过对培养的牛肝细胞添加NEFA和BHBA研究NEFA以及BHBA对牛肝细胞的结合珠蛋白(hap-toglobin,HP)和血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A protein,SAA) mRNA表达的影响。根据荧光定量PCR法测定NEFA、BHBA对体外培养牛肝细胞的HP和SAA mRNA表达的影响,以及NEFA、BHBA等代谢产物对急性期反应蛋白HP、SAA表达影响的结果,得出结论,中等浓度的NEFA对于体外新生犊牛肝细胞中的HP、SAA基因的表达具有促进作用,高浓度的NEFA对HP、SAA基因的表达影响较小;中等浓度的BHBA体外新生犊牛肝细胞中的HP、SAA基因的表达具有一定的抑制作用,中高浓度抑制作用不明显,对于SAA基因,只有BHBA在1. 2 mmol/L浓度下抑制作用明显,高浓度的BHBA对HP、SAA基因的表达影响很小。     

代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明代谢产物非酯化脂肪酸（NEFA）、β-羟丁酸（BHBA）和葡萄糖（GLU）在乳牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用实时荧光定量PCR法观察了NEFA、BHBA和GLU对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（GLNR）mRNA丰度的影响。结果，随着培养液中NEFA、BHBA和GLU浓度的升高，GLNRmRNA的表达量逐渐增加（P〈0．01）。表明，代谢产物NEFA、BHBA和GLU直接调控乳牛肝胰高血糖素受体mRNA的表达。     

中药制剂抗肉鸡热应激作用机理研究

将50只1日龄AA肉仔鸡饲养（高温条件下饲养）于MFD-233型人工气候室内,随机分成对照组和试验组,试验组肉仔鸡7日龄时在日粮中添加0．1％的中药,连用7d;然后分别于14,21日龄取法氏囊,用流式细胞仪检测应激状态下法氏囊细胞凋亡率和细胞周期时相变化,用Western—blot方法检测法氏囊中Bcl-2和caspase-3基因蛋白表达水平。试验结果表明：试验组肉仔鸡14,21日龄法氏囊细胞凋亡率明显低于对照组,差异显著（P〈0．05）;细胞周期时相发生变化,G1期细胞数量明显减少（P〈0．05）,G2期细胞数量明显增加（P〈0．05）,S期细胞数量变化不大（P〉0．05）;试验组肉仔鸡法氏囊中Bcl-2蛋白表达量高于对照组且差异显著（P〈0．05）,而caspase-3基因蛋白表达水平与Bcl-2相反,对照组表达量明显高于试验组且差异显著（P〈0．05）。这表明中药制剂对缓解热应激造成的法氏囊细胞凋亡作用可能是通过上调Bcl-2和下调caspase-3基因蛋白表达水平来完成的。     

玉米赤霉烯酮对Leydig细胞凋亡及caspase-9、caspase-3蛋白表达的影响

以不同浓度的玉米赤霉烯酮（Zearalenone,zEA）对大鼠睾丸间质细胞（Leydig）细胞进行染毒,采用噻唑蓝比色法观察了ZEA对Leydig细胞活力的影响;流式细胞术分析检测了ZEA对细胞的凋亡率、线粒体膜电位变化的影响;Westernblotting等技术检测了Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、PARP蛋白的表达情况。结果显示,ZEA可明显抑制睾丸Leydig细胞的活力（染毒各组与对照组比较P〈0．05）,40mg／L染毒组相对活力为40．67％;与对照组比较,5、10、20mg／LZEA染毒组睾丸Leydig细胞凋亡率均极显著升高（P〈0．05）,呈明显剂量关系;线粒体膜电位变化测定显示,各染毒组与对照组比,线粒体膜电位均下降（P〈0．05）,且有明显的剂量关系;Westernblotting分析显示,与对照组比较,5、10、20mg／LZEA染毒组Bax、caspase-9、caspase-3、PARP蛋白表达均上调,bel-2蛋白表达均下调。结果表明,ZEA能诱导大鼠睾丸间质细胞发生凋亡,Bax、Bcl-2、caspase-9、caspase-3等基因参与ZEA诱导Leydig细胞凋亡的调控。     

非酯化脂肪酸对体外培养犊牛原代肝细胞中炎性因子表达及其活性的影响

在建立犊牛原代肝细胞体外培养模型的基础上，通过培养液中添加不同浓度的非酯化脂肪酸（Nonesterifiedfatty acids，NEFAs），运用实时荧光定量PCR和ELISA方法，测定NEFAs对肝细胞中炎性因子TNFα、IL-6和IL-1β的mRNA表达及其活性的影响。结果显示，NEFAs作用肝细胞9h后，与对照组相比，高浓度NEFAs（1．8mmol／L）组肝细胞中TNFα、IL-1β的mRNA表达水平显著增加（P〈0．05），IL-6的mRNA表达水平在2．4retool／L时极显著增加（P〈0．01），低浓度NEFAs（0．6、1．2mmol／L）组肝细胞中TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平无显著差异（P〉0．05）；并且TNFα、IL-1G的活性在NEFAs浓度达到1．8、2．4mmol／L显著高于对照组（P〈0．01），且呈剂量依赖性作用，IL-6的活性在在NEFAs浓度达到1．8mmol／L显著高于对照组（P〈0．01），在2．4mmol／L也高于对照组，但差异不显著。结果表明，高浓度NEFAs在-定程度上能引起或加剧奶牛肝细胞炎性反应，可能是导致产后奶牛肝功能炎性损伤主要因素。     

高表达线粒体融合蛋白2(MFN2)可抑制高BHBA活化的奶牛肝细胞NF-κB炎性通路

为研究线粒体融合蛋白2(mitofusin 2,MFN2)对高β-羟丁酸(β-hydroxybutyrate,BHBA)活化NF-κB炎性通路的影响,体外培养奶牛肝细胞,添加不同浓度(0.0,1.2,2.4,4.8 mmol/L)的BHBA,并转染过表达MFN2的腺病毒,运用Western blot和qRT-PCR技术检测NF-κB炎性通路关键分子的基因和蛋白表达。结果显示,随着BHBA浓度的增加,IKBα和NF-κB p65的磷酸化水平以及IL-1β、IL-6和TNFα的mRNA表达均显著升高,MFN2的基因和蛋白表达水平则显著降低;过表达MFN2后,显著抑制了高BHBA诱导的IKBα和NF-κB p65磷酸化水平及IL-1β、IL-6、TNFαmRNA表达水平的升高。结果表明,在奶牛肝细胞中过表达MFN2可以显著抑制高BHBA活化的NF-κB炎性通路。     

p38MAPK抑制剂SB202190对猪颗粒细胞活力的影响

p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated potein kinase,MAPK)家族成员,是细胞内重要的信号转导系统之一,对细胞的生长、分化、凋亡具有重要影响及作用。为探究p38MAPK信号对猪卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响及其可能作用机制,研究以体外培养的猪卵巢颗粒细胞为模型,在培养液中分别添加浓度为0、1、10、20μmol/L的p38MAPK特异性抑制剂SB202190。以免疫细胞化学染色法鉴定体外培养猪卵巢颗粒细胞,通过CCK-8法检测其增殖活性,应用Annwxin V-FITC/PI及细胞周期试剂盒染色检测细胞凋亡及细胞周期状况,以实时定量PCR检测猪卵巢颗粒细胞中凋亡、周期相关基因的相对表达水平。结果表明,添加p38APK信号抑制剂SB202190可抑制体外培养猪卵巢颗粒细胞的增殖活性,20μmol/L处理组与其他组相比呈显著性差异(P0.05);20μmol/L SB202190添加处理未显著影响颗粒细胞的凋亡水平,而该浓度SB202190可将大部分细胞阻滞在G1/G0期,与对照组相比差异显著(P0.05);基因相对表达水平检测显示SB202190添加可抑制Fas、FasL、CDK-4的表达,而同时促进Bcl-2、Bax、P27的表达(P0.05),对Caspase-3的表达没显著影响(P0.05)。综上所述,SB202190通过调控猪卵巢颗粒细胞的周期来影响其增殖作用,但对其凋亡没有影响。     

MAPK信号通路在镉致大鼠肝细胞凋亡中的作用

探讨MAPK通路在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的作用.采用两步灌流法获得大鼠肝细胞,经过24 h培养,用醋酸镉、醋酸镉与MAPK抑制剂(p38抑制剂SB202190、JNK抑制剂SP600125、ERK抑制剂U0126)共同处理肝细胞.用MTT法检测细胞存活率,倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态和凋亡,免疫组织化学法检测p38蛋白表达.结果表明,镉可极显著提高肝细胞磷酸化p38的表达量(P＜0).01),而SB202190能极显著降低其表达(P＜0.01).SB202190可以显著或极显著提高镉处理组细胞的存活率(P＜0.05或P＜0.01),减少变形细胞和凋亡细胞数量,但SP600125和U0126作用相反.说明镉暴露导致肝细胞p38 MAPK途径激活而引起细胞凋亡.     

镉对大鼠大脑皮质神经细胞Bcl-2，Bax和Caspase-3mRNA转录的影响

为研究镉对大鼠大脑皮质神经细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3mRNA转录水平的影响,选用不同浓度（0、5、10、20μmol／L）醋酸镉染毒大鼠大脑皮质神经细胞12h,用MTT法检测细胞存活率,实时荧光定量PCR检测Bcl-2、Bax和Caspase-3mRNA的转录水平,并计算Bcl-2／Bax的比值。结果表明,与对照组相比,各染毒组细胞存活率随染毒剂量增加而显著下降（P〈0．05或P〈0．01）;Bax和Caspase-3mRNA转录水平极显著升高（P〈0．01）,而Bcl-2mRNA转录水平显著降低（P〈0．05）,Bcl-2／Bax极显著降低（P〈0．01）。说明镉能抑制大鼠大脑皮质神经细胞的生长,并可调节凋亡相关基因Bcl2、Bax和Caspase-3mRNA的转录。     

神经内分泌因子、代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素（In）、胰高血糖素（GLN）、瘦素（LEP）和代谢产物非酯化脂肪酸（NEFA）、β-羟丁酸（BHBA）、葡萄糖（GLU）在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）法观察了神经内分泌因子、代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（glucagon receptor，GLNR）mRNA丰度的影响。结果显示：随着培养液中In、NEFA、BHBA和GLU的升高，GI。NRmRNA表达逐渐增加（P〈0．01）；随着培养液中GLN浓度的升高，GLNRmRNA表达逐渐降低（P〈0．01）；而随着培养液中瘦素浓度的升高，GLNRmRNA的表达呈先升高后降低的趋势（P〈0．01）。表明：神经内分泌因子In、GLN、LEP和代谢产物NEFA、BHBA、GLU直接调控新生犊牛肝细胞GLNRIT／RNA的表达。     

葡萄糖对鹅原代肝细胞GPX1和SOD1基因表达及酶活力的影响

In order to investigate the effect of glucose on oxidative stress in cultured goose primary hepatocytes, partial gene sequences of GPX1 and SOD1 genes were cloned, and the goose primary hepatocytes were treated with different concentrations（0（control group）, 5, 25 and 35 mmol/L） of glucose for 48 h, and then enzyme activities of GPX and SOD and mRNA levels of GPX1 and SOD1 were examined. The results showed that goose GPX1 gene sequence had the highly similarity with Zebra Finch, and SOD1 had the highly similarity with Red Jungle fowl. Compared with the control group, 5 mmol/L glucose had no significant effect on GPX enzyme activity （P>0.05）, but 25 and 35 mmol/L glucose could significantly decrease GPX enzyme activity (P＜0.05).5 mmol/L glucose could significantly increase SOD enzyme activity （P＜0.05）, but 25 and 35 mmol/L glucose had no significant effects on SOD enzyme activity（P＞0.05）.35 mmol/L glucose could significantly increase mRNA expression of GPX1 and SOD1 genes （P＜0.05）, but 5 and 25 mmol/L glucose had no significant effects on the two genes（P＞0.05）.In conclusion, the high concentration glucose （35 mmol/L） could induce intracellular oxidative stress in goose primary hepatocytes.     

纳米氧化铜对鸡肝细胞CP mRNA表达及培养基质中肝酶活性的影响

将培养48h的鸡原代肝细胞随机分为13组,每组3个重复。第1组为对照组,第2～5、6～9和10～13组分别以硫酸铜、氧化铜和纳米氧化铜的形式添加铜2、4、8、16mg/L,继续培养24h后检测上清中AKP、AST、ALT、γ-GT和LDH活性,用实时荧光定量PCR法检测肝细胞CP mRNA表达量。结果显示,以硫酸铜形式添加铜2～16mg/L、以氧化铜形式添加铜8～16mg/L和以纳米氧化铜形式添加铜16mg/L,培养基质中γ-GT活性均显著高于对照组（P〈0.05）;添加铜2mg/L时,硫酸铜组γ-GT活性显著高于纳米氧化铜组（P〈0.05）,添加铜8mg/L时,氧化铜组γ-GT活性显著高于纳米氧化铜组（P〈0.05）。添加铜2mg/L时,硫酸铜和氧化铜组AST和LDH活性显著高于对照组和纳米氧化铜组（P〈0.05）。添加铜2mg/L时,氧化铜组ALT活性显著高于纳米氧化铜组（P〈0.05）。添加铜8mg/L时,硫酸铜和氧化铜组AKP活性显著高于对照组和纳米氧化铜组（P〈0.05）。添加铜2～8mg/L时,肝细胞CP mRNA表达量显著高于对照组（P〈0.05）;添加铜2mg/L时,纳米氧化铜组肝细胞CP mR-NA表达量显著高于氧化铜组（P〈0.05）,氧化铜组显著高于硫酸铜组（P〈0.05）;肝细胞CP mRNA表达量随铜添加量的增加而降低。结果表明,基质中铜达到2mg/L时,纳米氧化铜比硫酸铜、氧化铜更有利于肝细胞生长,纳米氧化铜对体外培养肝细胞的损害作用低于硫酸铜和氧化铜。     

Ⅰ型、Ⅱ型酮病对奶牛血液某些理化参数的影响

本试验旨在了解Ⅰ型、Ⅱ型酮病发生时奶牛体内某些理化参数的变化。在某集约化牛场随机选取产后7～28 d、平均胎次为2～3胎的试验奶牛,根据血浆中β-羟丁酸（BHBA）、葡萄糖（Glc）、游离脂肪酸（NEFA）的含量以及临床发病特点分为Ⅰ型酮病组（20头）、Ⅱ型酮病组（20头）和健康对照组（10头）。结果显示,三组间血浆中Glc、BH-BA、NEFA的浓度与体况评分存在显著差异（P＜0.05）,但三组试验奶牛的泌乳量、产后天数、血浆中胰岛素（INS）含量彼此间无显著性差异（P＞0.05）。Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病与健康对照组之间的理化参数存在显著差异,为深入探究奶牛Ⅰ型酮病与Ⅱ型酮临床病理学、早期检测和诊断以及详细的发病机理提供依据,为今后有效地预防奶牛Ⅰ型、Ⅱ型酮病奠定基础。     

稀释液中添加半胱氨酸对绵羊冷冻精液品质的影响

在绵羊冷冻精液稀释液中添加0mmol／L、2．5mmol／L、5．0mmol／L、7．5mmol／L4个不同梯度的半胱氨酸，通过测定解冻后的精子活率、畸形率、顶体完整率、质膜完整率以及各项酶（SOD、GSH、GSH-PX、CAT和MDA）的活性来确定最适添加量。结果表明，添加5．0mmol／L的半胱氨酸组的精子活率和顶体完整率均极显著高于对照组和其他组（尸〈0．01），而畸形率显著低于对照组和其他试验组（P〈0．05）；各项酶指标中，5．0mmol／L半胱氨酸组SOD和GSH浓度与其余各组间差异不显著（P〉0．05），MDA浓度极显著低于对照组和7．5mmol／L试验组（P〈0．01），CAT和GSH-PX活性极显著或显著高于对照组和其他试验组（P〈0．01，P〈0．05）。说明冷冻稀释液中添加5．0mmol／L的半胱氨酸可有效保护精子免受过氧化物的损害。     

17α-甲基睾酮对斑马鱼肝脏vtg基因mRNA表达的影响

为评价17α-甲基睾酮（17α-methyltestosterone,MT）对斑马鱼肝脏vtg基因m RNA表达的影响,利用MT处理斑马鱼雌、雄鱼7 d,采用实时定量PCR（q RT-PCR）检测雌、雄鱼肝脏中vtg基因m RNA的表达量。结果显示,MT处理雌鱼7 d,25 ng/L处理组肝脏vtg基因的表达量显著降低（P〈0.05）,50 ng/L和100 ng/L的MT处理组肝脏vtg基因m RNA表达量极显著降低（P〈0.01）;MT处理雄鱼7 d,25 ng/L处理组肝脏vtg基因m RNA表达量与对照组相比差异不显著（P〉0.05）,50 ng/L的MT处理组肝脏vtg基因m RNA表达量显著升高（P〈0.05）,100 ng/L的MT处理组肝脏vtg基因m RNA表达量极显著升高（P〈0.01）。斑马鱼肝脏vtg基因对MT比较敏感,可以作为监测环境中MT的生物标志物。     

重组脂联素对皖南花猪脂肪细胞脂联素及其受体mRNA表达的影响

脂联素（Adp）是主要由脂肪组织分泌的细胞因子,有重要的生理作用。本试验旨在研究重组脂联素（rAdp）对皖南花猪脂肪细胞脂联素及其受体2,AMP激活蛋白激酶（AMPK）、过氧化物增殖剂活化受体α（PPARα）mR-NA表达的影响。选择10d皖南花猪皮下脂肪组织分离前体脂肪细胞,增殖培养至80%融合后换分化培养基培养,细胞分化后用0、2和10mg/L rAdp分别处理12和48h。油红O染色法鉴定脂肪细胞,MTT方法检测细胞活力;酶法测定培养液中甘油释放量,荧光定量RT-PCR方法检测脂肪细胞脂联素（Adp）、脂联素受体1（AdpR1）、脂联素受体2（AdpR2）、PPARα和AMPK mRNA表达。结果显示,rAdp处理后,脂肪细胞活力总体有降低趋势,10mg/L处理48h达到显著水平（P〈0.05）;rAdp处理对甘油释放的抑制作用未达到差异水平。rAdp处理12h后,脂肪细胞AdpR1和AdpR2mRNA表达显著升高（P〈0.01）,但无剂量依赖性;rAdp处理48h后,脂肪细胞AdpmRNA表达显著下降（P〈0.05）。rAdp处理12h后,脂肪细胞PPARαmRNA表达显著升高（P〈0.01）,且有剂量效应性;而AMP AMPK mRNA表达均无显著性变化。结果提示,重组脂联素处理猪原代脂肪细胞有降低细胞活力和抑制脂肪细胞甘油释放量的趋势,能显著上调AdpR1、AdpR2和PPARα基因的表达,从而刺激脂肪酸氧化和甘油三酯的水解作用。     

β-羟丁酸抑制下丘脑神经细胞PIF基因表达和蛋白分泌

分离培养Wistar新生大鼠的下丘脑神经细胞,在培养第7天以不同浓度的β-羟丁酸（β-hydroxybutyric acid,BHBA）（0、0.05、0.5、1、2mmol/L）处理24h,收集上清和细胞,提取细胞总RNA,分别利用荧光定量RT-PCR和ELISA的方法检测催乳素释放抑制因子（Prolactin release-inhibiting factor,PIF）基因表达和蛋白分泌的变化。结果显示,BHBA能显著抑制PIF基因表达和蛋白分泌,而且具有剂量依赖性。结果表明,BHBA可能做为信号分子调节下丘脑的分泌功能。