SREBP-1c基因重组腺病毒的构建及其在犊牛原代肝细胞中的表达

将携带有化学合成的SREBP-1c基因的质粒先用Xba Ⅰ酶切,Klenow补平突出末端,纯化回收后再用Hind Ⅲ酶切,切胶回收目的基因片段;并将其克隆至用EcoR Ⅴ/HindⅢ酶切回收的pShuttle-EGFP-CMV(-)TEMP穿梭载体上.经酶切鉴定后,重组穿梭质粒和腺病毒pAdxsi质粒分别用I-Ceu Ⅰ+I-Sce Ⅰ双酶切处理,T4DNA连接酶连接,获得重组质粒pAdxsi-GFP-SREBP1c,酶切鉴定后经Pac Ⅰ酶切线性化转染HEK293细胞,经包装扩增后用TCID50测定病毒滴度.以重组腺病毒感染犊牛原代肝细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中SREBP1c mRNA和蛋白的表达量.结果显示,重组腺病毒酶切鉴定正确,滴度可达1.2×1010,腺病毒感染犊牛原代肝细胞中SREBP-1c mRNA和蛋白的表达显著升高.结果表明,本试验成功构建了SREBP-1c基因过表达重组腺病毒,且SREBP-1c在犊牛原代肝细胞中高度表达.     

p38介导β-羟丁酸对原代培养犊牛肝细胞凋亡的影响

本试验旨在探讨β-羟丁酸（BHBA）对体外原代培养犊牛肝细胞凋亡的影响以及p38MAPK在其中的调控作用。选择培养72h的肝细胞,添加不同浓度的BHBA（0、0．6、1．2、2．4mmol／L）,培养9h,每个浓度3个重复。另外选取细胞,p38MAPK抑制剂SB203580（10pmol／L）预处理1h后,添加BHBA,使其终浓度为2．4retool／L;PI／An—nexinV—FITC双染,运用荧光显微镜观察肝细胞凋亡情况;ELISA法检测p38的活性;实时荧光定量PCR方法检测p38、Caspase-3、Caspase9、bcl2基因的mRNA表达水平。结果表明,与对照组相比,1．2和2．4mmol／I—BHBA组的肝细胞凋亡明显增加;p38酶活性明显升高;p38、caspase-3和caspase-9基因mRNA表达水平均显著增加（P〈0．01）。bcl2基因mRNA表达水平显著降低（P〈0．05）;添加p38抑制剂后,caspase-3和caspase-9基因mRNA表达水平显著降低（P〈0．01）,bcl-2基因mRNA表达水平显著增加（P〈O．05）。高浓度的BHBA可以诱导体外原代培养犊牛肝细胞凋亡,p38在BHBA诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。     

非酯化脂肪酸对体外培养犊牛原代肝细胞中炎性因子表达及其活性的影响

在建立犊牛原代肝细胞体外培养模型的基础上，通过培养液中添加不同浓度的非酯化脂肪酸（Nonesterifiedfatty acids，NEFAs），运用实时荧光定量PCR和ELISA方法，测定NEFAs对肝细胞中炎性因子TNFα、IL-6和IL-1β的mRNA表达及其活性的影响。结果显示，NEFAs作用肝细胞9h后，与对照组相比，高浓度NEFAs（1．8mmol／L）组肝细胞中TNFα、IL-1β的mRNA表达水平显著增加（P〈0．05），IL-6的mRNA表达水平在2．4retool／L时极显著增加（P〈0．01），低浓度NEFAs（0．6、1．2mmol／L）组肝细胞中TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平无显著差异（P〉0．05）；并且TNFα、IL-1G的活性在NEFAs浓度达到1．8、2．4mmol／L显著高于对照组（P〈0．01），且呈剂量依赖性作用，IL-6的活性在在NEFAs浓度达到1．8mmol／L显著高于对照组（P〈0．01），在2．4mmol／L也高于对照组，但差异不显著。结果表明，高浓度NEFAs在-定程度上能引起或加剧奶牛肝细胞炎性反应，可能是导致产后奶牛肝功能炎性损伤主要因素。     

高寒林区圆管涵的病害与处置

大兴安岭地区气候寒冷,冻结期长,属多年冻土区。圆管涵的设计和施工,除了应遵守一般的基本原则外,还应根据冻土地区的特点进行设计和施工。据调查资料表明,我区内修建的圆管涵80％以上有不同程度的冻害发生,严重的甚至完全破坏,失去了泄洪能力。现将圆管涵的常见冻害和成因及在设计、施工和养护中的几点改进意见简述如一、圆管洒的常见病害和成因 1、压缩变形。林区公路主要行驶原条车和原木车,在重型车辆荷载的反复作用下,     

酮病和健康奶牛血清中触珠蛋白和血清淀粉样蛋白A浓度的比较研究

血清中触珠蛋白(HP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)浓度的变化与奶牛代谢性疾病(如酮病、脂肪肝等)密切相关.为了明确酮病奶牛和健康奶牛血清中触珠蛋白和血清淀粉样蛋白A浓度差异,本试验运用酶联免疫吸附试验(ELISA),分别测定了酮病和健康奶牛血清中触珠蛋白和血清淀粉样蛋白A浓度,结果显示,酮病奶牛血清中触珠蛋白浓度和SAA浓度极显著高于(P＜0.01)健康奶牛.结果表明,酮病奶牛普遍存在炎症等病理过程,这一结果可为进一步阐明奶牛酮病的发病机制提供理论依据.     

BHBA对体外培养牛肝细胞氧化应激状态及抗氧化关键酶活性和mRNA表达的影响

评价氧化应激状态有助于理解奶牛代谢紊乱性疾病(如酮病等)的发病机制.本研究以牛肝细胞体外培养模型为基础,通过细胞培养液中添加不同浓度的β-羟丁酸(BHBA),运用分光光度方法和实时荧光定量PCR(realtime PCR)技术,分别测定细胞裂解上清液中过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)的含量、总抗氧化能力(TCA)和过氧化氢酶(CAT)、总谷胱甘肽过氧化物酶(T-GSH-Px)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性,以及CAT、GSH-Px、Mn-SOD和Cu/Zn SOD mRNA表达水平的变化.结果显示,随着BHBA浓度的增加,肝细胞中H2O2和MDA的含量呈剂量依赖性增加,添加BHBA 24 h后,各组H2O2和MDA的含量均显著高于0、12和48 h.各时间点TCA含量随添加BHBA浓度的增加而降低.添加BHBA 12 h后,低浓度组(0.6mmol/L BHBA)T-SOD、T-GSH-Px和CAT的活性及CAT、GSH-Px、Mn-SOD和Cu/Zn SOD mRNA表达均显著高于对照组,高浓度组(1.2和2.4mmol/L BHBA)T SOD、T-GSH-Px和CAT的活性及CAT、GSH-Px、Mn-SOD和Cu/Zn SOD mRNA表达均低于对照组;添加BHBA 24、48h后,T SOD、T-GSH-Px和CAT的活性及CAT、GSH-Px、Mn-SOD和Cu/Zn SOD mR-NA表达均随BHBA浓度的增呈剂量依赖性抑制.结果表明,添加低浓度的BHBA可以维持体外培养肝细胞中氧化抗氧化系统的动态平衡,但高浓度BHBA影响该动态平衡,导致肝细胞处于氧化应激状态,引起氧化应激损伤,进而影响肝细胞的正常生理功能.