猪繁殖与呼吸综合征病毒HS株结构蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(VR-2332)基因序列,设计合成了ORF2a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的引物.利用RT-PCR扩增出PRRSV HS株各基因的cDNA片段,将扩增的各cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序.应用DNA Man软件,将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株(VR-2332、Resp MLV、16244B、HN1、BJ-4、CH1-a、HB-1、HB-2、LV)的相应基因进行序列比较,并绘制系统进化树.结果表明,PRRSV HS株与美洲型的相应基因核苷酸同源性为83.6%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为38.9%～49%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为86.6%～99.6%,与LV株的同源性为54.2%～78.2%.系统进化树表明,PRRSV HS株属于美洲型,与HN1、VR-2332、RespMLV、16244B、BJ-4亲缘关系较近.     

辽宁省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株ORF5-7基因遗传变异分析

根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332全基因序列,设计并合成2对引物,采用RT-PCR技术,对辽宁省站送检的病料进行分离扩增,分别获得相应的目的片段,将其分别克隆入pMD18-T载体中,并送上海生工测序。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCC VR-2332、CH-1a、BJ-4、LV-M96262及疫苗株的ORF567基因进行序列比较,通过核苷酸序列分析表明这5株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性为89.5%～95%,与LV-M96262的同源性为54%～58.3%.氨基酸序列分析表明这5株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性为82.8%～94.7%.     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒河南分离株ORF3～7基因克隆与序列分析

参照GenBank中公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲株ATCC VR2332的ORF3～7基因序列,利用Pri mer软件分别设计合成了针对PRRSV ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的特异性引物,利用RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株分别扩增得到了大小约964、675、718、566和501 bp的片段,并将扩增的片段插入PGEM-T-easy载体进行测序。利用DNAStar软件进行序列分析表明,河南分离株Hn-1/06株属于美洲型,同时将Hn-1/06株ORF3～7基因的核苷酸序列和推导氨基酸序列与ATCC VR2332、LV、Resp、CH-1a、BJ-4、S1、CC-1、HB-1、JX0612、HUB1等分离株进行了同源性分析。     

PRRSV上海浦东南汇分离株Nsp2与ORF5基因遗传演化分析

对上海浦东南汇地区某规模猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疑似病料进行处理,提取病毒总RNA,采用RT-PCR方法扩增Nsp2/ORF5基因,并进行基因测序。序列分析结果表明,浦东南汇分离株Nsp2蛋白均缺失481位和第533~561位30个不连续的氨基酸,同时在Nsp2编码区出现与高致病性PRRSV(HP-PRRSV)代表株JXA1相同的遗传变异现象。同源性分析表明,6株Nsp2、ORF5氨基酸序列与VR-2332、CH-1a、HB-2以及JXA1株的同源性分别为:40.3%~55.3%,73.5%~89.5%;54.7%~75.1%,75.5%~92.5%;50.9%~67.3%,73.5%~90.5%;72.8%~91.5%,81.5%~98.5%;而与欧洲型代表株LV株的同源性分别仅为26.2%~35.9%和44.8%~56.4%。遗传演化分析表明,浦东南汇分离株与国内株(CH-1a、HB-2)和VR-2332美洲代表株各自处于相对独立的分支,遗传关系较远且不存在交叉现象,而与JXA1变异株处于同一进化分支。研究表明,浦东南汇分离株为美洲型HP-PRRSV毒株,具有一定的地理衍变特性,已从PRRSV遗传进化树中分离,出现一个新的遗传独立群体。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GXA株分离及主要结构基因的克隆和序列分析

近来,广西一些养殖场频繁发生以母猪流产、死胎、木乃伊、仔猪呼吸道症状等为特征的流行性传染病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染所致。本研究从病猪中采集材料,经RT-PCR检测为阳性后,接种于Marc-145细胞,经过6代盲传,发现典型的细胞病理变化(CPE),经鉴定为PRRSV,命名为GXA株,其毒价为105.33TCID50/mL。参考VR-2332和CH-1a株基因序列,设计了3对特异性引物,分别对GXA株的E、M、N基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。应用DNAstar生物学软件拼接得到GXA株的E、M和N3个基因片段共长为1473bp。同源性分析表明,GXA株与VR-2332、MLV和BJ-4的同源性为99.7%～100%,而与欧洲型代表株LV的同源性只有66.4%。表明GXA与VR-2332、MLV及BJ-4株亲缘关系比较密切,与欧洲型代表株LV亲缘关系最远,属于美洲型毒株,有可能来源于疫苗株。     

2014年-2016年广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2和ORF5基因的遗传多样性分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传进化情况,对2014年-2016年来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2和ORF5基因的扩增和测序分析.结果获得34个Nsp2基因序列和45个ORF5基因序列,均属于美洲型毒株.Nsp2基因间核苷酸序列的同源性为91.8％~100％,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为81.3％~84.3％、88.9％~92.1％、94.3％~99.3％和73.5％~75.1％,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为51.5％~53.2％.ORF5基因间核苷酸序列的同源性为82.8％~100％,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为83.7％~99.5％、85％~95％、83.8％~99.7％和83.2％~86.4％,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为62.4％~64.5％.基于Nsp2和ORF5基因推导的氨基酸序列绘制的遗传进化树中,广西地区的毒株主要分布在以JXA1为代表的Ⅳ亚群.表明当前广西PRRSV流行毒株以JXA1株为代表的高致病性美洲型毒株为主,各毒株Nsp2和ORF5基因序列存在一定的差异,尚未发现欧洲型毒株和美洲型NADC30类毒株.     

福建地区猪繁殖与呼吸综合征ORF7基因遗传变异分析

为了解福建地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律,收集了福建省不同地区的12株PRRSV,并对其ORF7基因进行遗传变异分析。结果表明,福建地区存在欧洲型PRRS和美洲型PRRS,10株为美洲型PRRSV,与VR-2332、JXA1等美洲型参考毒株的氨基酸的同源性为89.5%~100%,与欧洲代表毒株LV的氨基酸的同源性分别为59.5%~63.6%。而FJ-11、FJ-12 2株分离株为欧洲型PRRSV,与欧洲代表毒株LV的氨基酸的同源性分别为91.4%、92.2%,而与VR-2332、CH-1a等美洲参考毒株的氨基酸的同源性为60.3%~64.5%。美洲型PRRSV ORF7编码N蛋白氨基酸虽然发生了变异,但相对保守。     

江西PRRS流行毒株ORF7基因遗传变异分析

江西某4个猪场发生以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状等为特征的传染病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染所致.本研究对送检病料进行RT-PCR检测为阳性后,克隆出PRRSV ORF7基因,序列分析表明4个序列之间同源性是98.7%～100%,同源性很高;与美洲型蓝耳病标准毒株VR-2332的同源性为93.3%～94.6%,与疫苗株MLV的序列同源性在93.3%～94.6%;而与欧洲株LV的同源性只有58.1%～58.6%.结果表明这4个毒株与VR-2332和MLV株亲缘关系比较密切,属于美洲型毒株.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF5基因的序列分析

采用RT-PCR方法对2009—2011年山西省疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得5个ORF5基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果表明,5个ORF5基因序列之间核苷酸同源性为97.7%～98.5%,与欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR-2332、2006—2007年国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)、2006年以前中国分离毒株(CH-1a、HB-1(sh)、HB-2(sh))和2个疫苗株(Resp PRRS MLV、MLV RespPRRS/Repro)核苷酸同源性分别为63.5%～64.0%、88.7%～89.2%、97.7%～99.3%、88.1%～96.7%和88.6%～89.1%;氨基酸同源性分别为56.1%～56.6%、87.8%～88.8%、96.6%～98.5%、85.9%～93.2%、86.8%～87.9%。结果表明山西地区的PRRSV流行毒株均属于美洲型,且毒株同源性很高,亲缘关系紧密。     

PRRSV HN25株ORF5基因的克隆和重组腺病毒的构建

克隆PRRSV HN25株ORF5基因,测序并进行序列分析。结果显示ORF5基因编码区长603bp,编码200个氨基酸,与国内外VR-2332株、LV株和CH-1a株ORF5基因的核酸序列同源性分别为99.0%,63.8%和91.4%,而推导的氨基酸序列同源性分别为98.0%,58.8%和90.5%。构建含ORF5基因的重组腺病毒穿梭质粒,PmeI酶切线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,同源重组后筛选重组腺病毒质粒,经PacI酶切后转染293A细胞进行包装,获得重组腺病毒。通过PCR鉴定重组腺病毒含有ORF5基因,Western blot检测的结果表明PRRSV ORF5基因在293A细胞内获得表达。     

我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因的遗传变异分析

参考Genbank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PKRSV）ATCC VR-2332的ORF5基因序列，设计并合成了一对引物．对来自福建、浙江、山东等地的PRRSV分离毒株进行RT-PCR扩增．获得约748bp的DNA片断，将其分别克隆入pMD18-T载体中，并进行测序。应用DNAStar软件分析所测序列，并与ATCCVR-2332、CH-1a、MLV、Lv等毒株的ORF5序列进行比较，结果表明：SHDl与F114、MLV、ATCCVR-2332同源性高达98．5％，与CH-1a同源性为91．0％，与其它毒株同源性为86．6％~88．4％；F114与MLV、ATCCVR-2332同源性为99．3％～99．7％．其余分离毒株在遗传关系上和CH-1a又分为明显的两个群．显示近年来各地PRRSV分离毒株与cH-1a株的遗传差异越来越大。     

2005年-2010年我国部分地区PRRSV流行毒株的遗传变异分析

为了掌握高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,揭示该病的发生规律,根据GenBank登录的PRRSV基因序列设计引物,采用RT-PCR法对2005年-2010年间送检的282份病料进行了PRRSV核酸检测,对其中9份阳性样品进行了ORF5～7基因片段扩增和测序,所得序列与GenBank下栽的PRRSV...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株NSP2基因的序列分析

为了分析河北省流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2基因的变异情况,试验对2009年采自秦唐部分地区和廊坊地区的临床发病猪肺组织提取RNA,通过RT-PCR扩增样本中PRRSV的NSP2全序列,并对其进行生物信息学分析,应用DNAStar软件将其与VR-2332、CH-la、MLV、BJ-4、HB-1、HB-2、JXA1、HUB1、HEB1等毒株进行序列比对。结果表明:河北地方株NSP2基因全长2 850 bp,编码的氨基酸均缺失30个不连续的氨基酸;其与国内2006—2007年间分离的JXA1、HUB1、HEB1等高致病毒株亲缘关系较近,而与更早的分离株和疫苗MLV株亲缘关系较远。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株的鉴定及部分Nsp2基因序列分析

本研究采集山西省不同地区的发病猪脏器组织与血液样品,采用特异性 RT-PCR方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)样品16份,应用设计的特异性引物扩增出Nsp2基因序列,利用DNAStar生物信息学分析软件,对获得的序列与国外代表毒株VR-2332、国内代表毒株CH-1a、BJ-4、HB-1及PRRSV变异毒株HuN4和JXA1的序列进行了比较,绘制系统发生树。氨基酸序列比较分析发现山西省流行毒株同源性分别在69.8%~71.7%、85.3%~87.9%、68.7%~70.6%、91.7%~94.3%、94.3%~98.5%、95.1%~98.9%。所获得的16株病毒之间的同源性在90.9%~100%之间。研究结果发现所获得的序列同源性与国内近几年流行的PRRSV的变异毒株HuN4和JXA1毒株的序列同源性最高,分别在94.3%~98.5%与95.1%~98.9%之间,Nsp2 基因缺失位置一致,其Nsp2均有2个部位出现了缺失,即Nsp2基因分别为编码1个氨基酸的3个核苷酸的缺失和编码29个氨基酸的连续87个核苷酸的缺失,结果表明,山西省目前流行PRRSV的变异毒株与国内流行株属于同一分支。     

2007-2010年河北省部分地区猪繁殖与呼吸综合征分子流行病学

为了弄清河北省秦皇岛、唐山、廊坊、邯郸等部分地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF5和Nsp2基因变异情况,对采自以上地区在2007—2010年期间的临床发病猪肺组织,提取其RNA,通过RT—PCR扩增样本中PRRSV的ORF5和Nsp2基因,对目的基因测序,并以VR-2332、CH—la、MLV、LV、HB-1、HB-2、JXA1、HUB1、HEB1等毒株为参考序列,进行序列分析和进化树分析。扩增出42个ORF5基因,14个Nsp2基因,通过完整的ORF5和部分Nsp2基因序列比较分析发现所有毒株均为美洲型,且大多数毒株与国内2006—2007年间分离的JXA1、HUB1、HEB1等高致病力毒株同源关系很近。42个ORF5基因编码的氨基酸序列分析表明GP5蛋白的糖基化位点数量和位置已发生变异,主要中和表位存在氨基酸变异（L／F^35→I^39）,与毒力相关的13位和151位点为强毒株的氨基酸特性（R^13、R^151）。14个Nsp2基因推导的氨基酸系列比较发现,1株PRRSV Nsp2基因未发生缺失突变,而剩余的13个毒株Nsp2基因均发生了氨基酸缺失,在481位和532～560位2处分别缺失1和29个氨基酸。系统发育进化树结果显示河北部分地区流行株分为2个小分支,1个毒株与HB-1聚为1支;河北流行株的大多数毒株在另一个分支,与高致病力毒株JXA1等聚为一支。本研究结果揭示了河北省部分地区流行的PRRSV ORF5和Nsp2基因的变异特征,丰富了河北省的PRRSV分子流行病学资料,提示要针对ORF5和Nsp2基因的变异采取PRRSV的防控措施。     

Genetic variation analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolated in China from 2002 to 2007 based on ORF5

The complete open reading frame 5 (ORF5) sequences of 34 field porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolates from China in 2002–2007 were detected and compared with the different variable Chinese isolates S1, CH-1a, HB-1, HB-2 and JXA1. The results showed that all isolates were of type 2 PRRSV and could be assigned to two clusters. The isolates in cluster sg1 was high similar with the highly pathogenic PRRSV strain JXA1, while sg2 clustered with type 2 PRRSV isolate VR2332. It was interesting that the isolate SH02 which was isolated from Shanghai in 2002 has 98.8% identity with JXA1 emerged in 2006. And the ZJJ07 isolate was found to be a natural recombinant between a Chinese highly pathogenic SY0608 isolate and a VR-2332 derivative NH04 isolate. Analysis of the potential glycosylation sites indicated that they were frequently mutated and formed five putative N-linked glycosylation (NGS) sites patterns based on N30, 33–35, 44 and 51 in those isolates. It indicated that the highly variable PRRSV strain with different NGS patterns spread widely in China. The great genetic diversity could be taken into consideration for the control and prevention of this disease.     

我国部分省区HP-PRRSV分离株ORF5基因遗传变异分析

参考GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV ) JXA1的ORF5基因序列,设计并合成了一对引物,对分离自云南、浙江、山东、辽宁、黑龙江、天津、湖南等7省12株PRRSV分离株进行RT-PCR扩增,获得约773 bp的DNA片段,将其分别克隆至pGEM-T Easy载体中,并进行测序.应用DNAStar软件分析序列,并与VR-2332、CH-la、MLV、LV、BJ4、HB1、HuB2、JXA1等毒株ORF5序列进行比较,结果表明,分离株间的核苷酸同源性为91.9%～100%,氨基酸同源性为90.1%～100%;在美洲株遗传关系上又分为明显的2个群:12株分离株与HB1、HuB2、JXA1、CH-la亲缘关系比较近,处于一个亚群;VR-2332、MLV、BJ4处于另一个亚群.说明高致病PRRSV为我国PRRS主要流行病毒.