中国大鲵脑cDNA文库构建及促甲状腺激素β亚基基因cDNA的克隆和序列分析

以大鲵脑组织为材料,提取总RNA,应用CloneminerTM文库构建技术构建了cDNA文库.经检测,文库初始滴度为5.0×105 cfu·mL-1,重组率为91.70%,插入片断大小在0.35～3.9 kb,平均插入片段大小为0.791 kb,文库扩增后滴度为4.0×109 cfu·mL-1.随机挑选200个阳性克隆测序,经生物信息学分析,发现20个片段与已报道的基因有较高同源性,包括促甲状腺激素基因、生长激素基因及催乳素基因等,其中三个克隆为促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因.序列分析表明,TSHβ cDNA全长序列为705 bp,包含417 bp开放读码框,编码138个氨基酸序列,其中前19个氨基酸为大鲵TSHβ亚基信号肽部分,后接119个氨基酸组成的TSHβ亚基成熟肽.同源性分析显示,大鲵TSHβ亚基与两栖类牛蛙、蟾蜍及爪蟾同一蛋白的同源性分别为53.6%、52.2%和60.3%.采用邻接法和最大简约法对部分脊椎动物TSHβ氨基酸序列构建分子系统树,结果显示有尾目大鲵为两栖动物中较早分化的一支,表明其进化地位较原始.RT-PCR组织分布分析发现,TSHβ基因除垂体有表达外,性腺也有少量表达.     

黄鳝β－肌动蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT—PCR和RACE法，从黄鳝(Monopterus albus Zuieuw)肝脏中分离和克隆黄鳝β-肌动蛋白(actin)基因。该基因cDNA全长l765bp[不包括poly(A)]，5’端非翻译区12bp，3’端非翻译区有625bp[不包含poly(A)]，阅读框(Open reading frame，ORF)1128bp，翻译成375个氨基酸，蛋白质分子量41．77kD。将所得序列与各科鱼、蛙、鸡、牛、鼠、人等的β-肌动蛋白基因序列同源性分析显示，核苷酸序列具有68％～95％的相似性，氨基酸序列具有97％～100％相似性，显示该基因在生物进化过程中的保守；系统发育分析表明黄鳝β-肌动蛋白基因与罗非鱼的亲缘关系最近。     

RACE法分离团头鲂生长抑素全长cDNA及其序列测定

生长抑素具有抑制脑垂体GH释放的作用，是调控鱼类生长的主要激素之一。本研究采用RT和RACE(rapid amplification of cDNA ends)法，分离和测定了团头鲂脑中生长抑素PSSI cDNA的全长核苷酸序列，并对该基因进行了结构和系统进化分析。3’RACE扩增得到700bp左右的片段，5’RACE分离得到500bp左右的片段，把3’片段与5’片段拼接得到全长cDNA。cDNA全长735bp[不含poly(A)]，5’端非翻译区有100nt。3’端290bp[不包含poly(A)]，阅读框(open reading frame，ORF)345bp。该序列与金鱼PSSI cDNA序列同源性为90％，主要差异在5’端非翻译区。团头鲂生长抑素mRNA阅读框编码114个氨基酸，包括一些酶切位点，产生26个氨基酸的大分子态生长抑素，进一步加工成与人等结构相似的14个氨基酸的生长抑素；团头鲂生长抑素前体氨基酸序列与金鱼、虹鳟、鲶鱼、鲅鱇、蛙、牛、鼠、鸡、猴、人等的比较发现，它与金鱼的同源性最高达95％，与鮟鱇最低50％，与人68％。这说明生长抑素基因在长期的进化中相当保守，同时，也因为鱼类生活环境多样导致基因变异较大。     

罗非鱼谷胱甘肽过氧化物酶1基因的克隆与分析

采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技术，克隆了罗非鱼（Oreochromis niloticus）谷胱甘肽过氧化物酶1（glutathione pemxidasel，GPx1）基因完整的编码序列（complete coding sequence，CDS）。GPx1基因全长984bp，5’uTR56bp，CDS576bp，3’UTR352bp，PolyA20bp；第791—885位碱基（位于3’UTR）形成1个硒半胱氨酸插入序列（selenocysteine insertion sequence，SECIS），协助174～176位密码子TGA（UGA）编码1个硒半胱氨酸（Sec）。GPx1包含191个氨基酸，分子量21．8kDa，等电点8．04，无信号肽和潜在的N．糖基化位点。蛋白结构分析表明该基因编码蛋白为非跨膜蛋白。序列比对显示，GPx1单体具有Sec、Trp、Gln和Asn构成的催化四联体。罗非鱼GPx1与其他脊椎动物GPx1相比较，核苷酸序列相似性为43．2％-58．2％，氨基酸序列相似性为58．1％～80．6％。进化分析显示，处在分类学上不同纲的脊椎动物GPx1分别占据了不同分支。利用Swiss-Model预测了罗非鱼GPx1的3D结构，序列分析显示，GPx1可以形成1个同源四聚体。     

日本鳗鲡脂肪酸去饱和酶和延长酶基因的克隆与分析

利用RT—PCR和RACE方法克隆得到日本鳗鲡（Anguilla japonica）肝脏中控制高不饱和脂肪酸（highly unsaturated fatty acids，HUFA）合成的脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase，FAD）和脂肪酸延长酶（fatty acid elongase，ELO）全长cDNA序列。结果表明，2456bp的FAD全长cDNA序列含长达1046bp的3’-UTR、75bp的5’-UTR和编码444个氨基酸的长1335bp的阅读框。编码的蛋白序列含有FAD全部的特征结构区，包括3个组氨酸簇、2个跨膜区和1个细胞色素h5结构域，与其他具有不同生活史鱼类的FAD氨基酸序列具有70．5％～77．5％的同源性；分析显示其在系统树中与溯河洄游鱼类的亲缘关系最近。克隆得到的ELO全长cDNA序列长1239bp，含有885bp的开放阅读框，编码294个氨基酸，该蛋白序列含有单一的氧化还原中心组氨酸簇、内质网停留信号和多个跨膜区等ELO特征结构，与其他鱼类ELO氨基酸具有87．1％～88．8％的同源性；其在系统树中与北非鲶鱼（Clarias gariepinus）和斑马鱼亲缘关系较近。日本鳗鲡FAD和ELOcDNA全序列的获得为今后进一步研究其体内高不饱和脂肪酸合成途径及阐明该途径在不同鱼类中的分子进化机理奠定基础。     

军曹鱼MHC-Ⅰα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法，得到1330bp的军曹鱼（Rachycentroncanadum）MHC-Ⅰα全长cDNA片段。该序列包括76bp的5’末端非编码区（UTR），189bp的3’UTR及1065bp的开放阅读框（ORF），编码354个氨基酸，预测其蛋白质分子量约40．10kDa，等电点5．70。构建MHC-Ⅰα氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸相似性比对，结果表明，军曹鱼和已知鱼类及人类（Homosapiens）MHC-Ⅰα氨基酸的同源性在27．9％～67．1％之间。所推测的蛋白序列具有一些重要特征，包括前导肽、α1、α2、α3区、CP／TM／CYT区和保守的半胱氨酸等。Real—timePCR检测结果显示，MHC-Ⅰα基因在各个正常军曹鱼组织中均表达，但表达量各有不同，其中较强的表达于头肾；中等程度表达于鳃、脾和肠；在心、脑和肌肉中表达较弱。     

5种鲤形目鱼的β珠蛋白基因cDNA的克隆

根据β珠蛋白的N末端和C末端氨基酸序列的保守性设计20bp长的简并引物，用RT—PCR方法扩增并克隆了鲤(Cyprinus carpio)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲫(Carassius auratus Linnacus）、泥鳅(Misgurnus anguillicau-datus)、大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)5种鲤形目鱼的β珠蛋白基因cDNA。结果表明，克隆的5种鲤形目鱼的β珠蛋白基因cDNA全长为441bp。但它们所编码的氨基酸序列却有较大的差异，鲤和泥鳅的序列相似性最高，达97．93％，而泥鳅和大鳞副泥鳅的相似性最小，仅有80．68％，其余的相似性介于二者之间。     

团头鲂(Megahbrama amblycephala) Caspase 9 基因全长cDNA的克隆及在氨氮胁迫下的表达分析

为了解团头鲂(Megahbrama amblycephala) Caspase 9基因序列特征及其在氨氮胁迫过程中的作用,应用末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆得到团头鲂Caspase 9基因全长1613 bp的cDNA序列,包括185 bp的5 '末端非翻译区(Untranslated regions,UTR)、96 bp的3'UTR、1332 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF).氨基酸多序列比对显示,平均同源性为77.74％,表明团头鲂Caspase9基因具有较高的保守性;系统进化分析显示,该基因氨基酸序列与其他鱼类Caspase 9聚为一支,并与锦鲤(Cyprinus carpio) Caspase 9亲缘关系较近;荧光定量PCR结果显示,Caspase 9基因在团头鲂各组织中均有表达,在脑中表达量最高,在肌肉中表达量最低,同时,在胁迫和恢复过程中,该基因在肝和脑中的表达规律相似,均在胁迫期间出现表达量上调,整体呈类似波浪形表达谱.研究结果表明,氨氮胁迫下,Caspase 9基因参与团头鲂的免疫防御,并与细胞凋亡分子过程有关.本研究结果可为进一步了解团头鲂应答氨氮胁迫分子机制提供理论依据.     

大珠母贝（Pinctada maxima）金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析

金属硫蛋白（Metallothionein，MT）是一类普遍存在于生物体内、分子量低、半胱氨酸含量丰富、能够与二价重金属离子结合的蛋白质。MT在清除自由基、解除重金属毒性、参与体内微量元素代谢、防止细胞癌变等方面具有重要作用。本研究通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库，首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白（PmMT）全长cDNA序列。该序列全长599bp，5’UTR（Untranslated Region）为75bp，3’UTR为296bp，开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）为228bp，编码75个氨基酸。编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富，达到29．3％；赖氨酸和甘氨酸含量也较高，均为9．3％；不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸；含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列。序列特征分析表明，该序列具备金属硫蛋白的典型特征，是金属硫蛋白家族成员。     

团头鲂铁蛋白基因的克隆及其在嗜水气单胞菌感染下的表达

利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆团头鲂Megalobrama amblycephala铁蛋白基因c DNA全长序列;同时研究经嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila攻毒后团头鲂肝组织中铁蛋白表达的变化,了解铁蛋白基因在团头鲂免疫应答中的作用。结果表明:团头鲂铁蛋白c DNA全长序列包括150bp的5’末端序列(untranslated region,UTR),270bp的3’UTR,以及522bp编码174个氨基酸的开放阅读框(open reading frame,ORF)。这些氨基酸序列同其他鱼类铁蛋白M链氨基酸序列同源性较高。团头鲂铁蛋白基因在5’非编码区核甘酸序列124~154的位置有个特殊的结构,即铁反应元件(iron response element,IRE)。荧光定量PCR分析表明:铁蛋白基因在团头鲂肌肉、心脏、鳃、肝胰脏、脑和肾脏等组织器官中都有表达,在肝胰脏的表达量最高,脑组织表达量最低。经嗜水气单胞菌急性感染后,团头鲂肝胰脏组织中铁蛋白基因表达量显著上调。上述结果表明:团头鲂铁蛋白M亚基在团头鲂免疫应答过程中起重要作用。     

鳜胃蛋白酶原基因cDNA全长的克隆与序列分析

利用RT–PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆鳜(Siniperca chuatsi)胃蛋白酶原基因cDNA全长序列，并对该基因的结构特征和系统进化关系进行了分析。鳜胃蛋白酶原基因cDNA序列全长1367 bp，5′端非翻译区43 bp，3′端非翻译区187 bp，开放阅读框(ORF)1137 bp，共编码378个氨基酸。鳜胃蛋白酶原氨基末端存在信号肽和激活肽序列，序列中含有催化活性必需的2个天冬氨酸残基和构成二硫键的6个半胱氨酸残基。鳜胃蛋白酶原氨基酸序列与其他脊椎动物胃蛋白酶原氨基酸序列的同源性为59.9%～91.2%，表明胃蛋白酶原基因在脊椎动物的长期进化中比较保守。鳜胃蛋白酶原基因的成功克隆不仅为进一步研究该基因的时空表达奠定基础，而且为鱼类胃蛋白酶原的分子特征和进化提供了新的资料。     

三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

采用RTPCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1 483 bp,由长92 bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),257 bp的3′非翻译区,和1 134 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为41.9 ku,理论等电点为5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178,Ser305,Ser321,Pro325,Val331,Pro346等6个氨基酸残基具有特异性,此外还发现3个特殊的氨基酸残基位点以及2个软体动物特有的氨基酸残基。三角帆蚌β-actin氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达98%~99%。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。RT-PCR显示β-actin基因在外套膜、血液、肝、肾、胃、肠、鳃、斧足共8个组织的表达基本一致,具有良好的稳定性。     

团头鲂(Megahbrama amblycephala) Caspase 9基因全长cDNA的克隆及在氨氮胁迫下的表达分析

为了解团头鲂(Megahbrama amblycephala)Caspase 9基因序列特征及其在氨氮胁迫过程中的作用,应用末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆得到团头鲂Caspase 9基因全长1613 bp的cDNA序列,包括185 bp的5'末端非翻译区(Untranslated regions,UTR)、96 bp的3'UTR、1332 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。氨基酸多序列比对显示,平均同源性为77.74%,表明团头鲂Caspase 9基因具有较高的保守性;系统进化分析显示,该基因氨基酸序列与其他鱼类Caspase 9聚为一支,并与锦鲤(Cyprinus carpio)Caspase 9亲缘关系较近;荧光定量PCR结果显示,Caspase 9基因在团头鲂各组织中均有表达,在脑中表达量最高,在肌肉中表达量最低,同时,在胁迫和恢复过程中,该基因在肝和脑中的表达规律相似,均在胁迫期间出现表达量上调,整体呈类似波浪形表达谱。研究结果表明,氨氮胁迫下,Caspase 9基因参与团头鲂的免疫防御,并与细胞凋亡分子过程有关。本研究结果可为进一步了解团头鲂应答氨氮胁迫分子机制提供理论依据。     

军曹鱼白细胞介素1β基因的克隆、分析及表达

采用同源克隆和锚定PCR技术，从军曹鱼(Rachycentron canadium Linnaeus)中克隆到白细胞介素1β(interleukin-1β)基因cDNA的全序列。军曹鱼IL-1β的cDNA全长1104bp，3′非编码区域(UTR)为255bp，5′UTR为108bp，开放阅读框(ORF)为741bp，编码246个氨基酸，分子量大约为27．68kD，理论等电点为5．71。同源性分析表明，该序列与其他鱼类甚至哺乳动物的IL-1β基因具有很高的相似性，并含有白细胞介素家族的签名序列(signature)。同时，利用RT—PCR技术，对特异性病原刺激下该基因在鱼体内的表达情况进行初步研究，发现IL-1β基因在鱼体的多种组织中都有表达，而经过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后，目的基因在组织中的表达明显增加，但是在不同组织内的表达存在差异。研究显示，军曹鱼IL-1β基因存在组成型和诱导型2种表达调控机制，在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

鳜胃蛋白酶原A、胃质子泵基因cDNA全长的克隆与细胞表达定位

利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了鳜全长1 322 bp的胃蛋白酶原(pepsinogen,PG)A2 cDNA序列,含1 131 bp的开放阅读框(ORF),共编码376个氨基酸,氨基酸序列包含信号肽、激活肽和胃蛋白酶3部分,胃蛋白酶部分含有2个天冬氨酸活性位点和3个二硫键。鳜胃蛋白酶 A2与A1在序列组成、理化性质、功能位点、空间结构上存在明显差异,表明它们可能具有不同的催化功能。胃质子泵(gastric H⁺/K⁺-ATPase)是胃酸分泌的关键性酶,研究克隆获得了鳜全长3 581 bp和1 669 bp的胃质子泵α、β亚基cDNA序列。序列相似性分析显示,胃质子泵α亚基具有高度保守性,含多个功能位点,而β亚基具有相对可变性。原位杂交(in situ hybridization,ISH)结果显示,鳜PG A1、PG A2和胃质子泵α亚基mRNA均在胃腺的同一类型细胞中表达,该细胞兼有分泌PG和胃酸的功能,鳜胃腺分泌细胞属于泌酸胃酶细胞。     

奥利亚罗非鱼雌激素β受体两种亚型cDNA的克隆、组织分布及雌激素对其表达的影响

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了奥利亚罗非鱼β雌激素受体基因(estrogen receptorβ,ERβ)两种亚型的cDNA全序列(ERβ1和ERβ2)。荧光定量PCR分析雌雄奥利亚罗非鱼两种亚型的组织分布,并观察注射外源雌激素对雄性奥利亚罗非鱼下丘脑-垂体-性腺轴雌激素受体ERα和β(β1/β2)基因表达的影响。序列分析表明,ERβ1cDNA全长为4262bp,其中包含239bp5′非编码区,2349bp3′非编码区和1674bp的开放阅读框,共编码557个氨基酸。ERβ2 cDNA全长为2506bp,包含5′非编码区393bp,3′非编码区109bp,阅读框为2004bp,共编码667个氨基酸。氨基酸序列同源性分析显示奥利亚罗非鱼ERβ1与尼罗罗非鱼的相似性高达99.1%,而与鲈形目其它鱼类的相似性为82.6%～94.2%。ERβ2氨基酸序列与尼罗罗非鱼的相似性为98.7%,与大口黑鲈、虹鳟、底鳉及斑马鱼的相似性分别为81.8%、76.3%、64.7%和55.0%。在系统进化树上奥利亚罗非鱼的ERβ1和ERβ2分别与尼罗罗非鱼的相应受体聚类。奥利亚罗非鱼ERβ1/β2基因在所检测的10种组织中均有...     

剑尾鱼 2 种卵黄蛋白原全长 cDNA 的克隆及序列分析

卵黄蛋白原是环境雌激素效应研究的重要生物标志物,广泛应用于水环境内分泌干扰物污染的评价。本研究利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆获得了剑尾鱼(Xiphophorus helleri)的2种卵黄蛋白原基因—VgA和VgB,并对其基因结构和系统进化进行分析。VgA基因cDNA序列全长5159bp,开放阅读框(ORF)5058bp,编码1685个氨基酸。VgB基因cDNA序列全长5349bp,开放阅读框(ORF)5067bp,编码1688个氨基酸。2种cDNA序列均具有与已发现的卵黄蛋白原分子相似的主要特征和功能域,包括Vitellogenin结构域、VWFD结构域和多聚丝氨酸区域,且与已知其他鱼类卵黄蛋白原基因有较高的同源性。     

团头鲂PGPHα亚基基因5’端侧翼序列克隆及其表达载体的构建

首先运用PCR-末端加尾法克隆了团头鲂（Megalobrama amblycephala）脑下垂体糖蛋白激素α亚基（Pituitary glycoprotein hormone α subunit,PGPH α）基因5’端侧翼序列;然后利用生物信息学理论对该序列进行了序列分析;最后在序列分析结果的基础上,构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示,克隆所得到的团头鲂PGPH α亚基基因5’端侧翼序列长1399bp;其序列中包含潜在的TATA盒、GC盒,以及ERE、TRE、CRE、PGBE等对PGPH α亚基基因转录调控起重要作用的转录因子结合位点;启动子区域位于-40-10bp处。利用PCR方法扩增得到了全长1439bp以及1120bp、532bp、173bp均包含转录起始位点下游40bp序列的缺失片段,并将其连接至pGL3-Basic报告基因载体,成功构建了团头鲂PGPH α亚基基因5’端侧翼序列的表达载体,为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础。     

三角鲂形态特征和胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的序列分析

对三角鲂(mEGALOBRAMA TERMINALIS)形态学特征进行研究，用RT—PCR的方法从三角鲂肝脏克隆了三角鲂胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因的cDNA序列。三角鲂传统的形态学数据与团头鲂相似。序列分析表明，三角鲂ICE-Ⅰ cDNA由486个核苷酸构成，编码161个氨基酸，包含整个信号肽、B、C、A、D和E区，与鲂属团头鲂比较，三角鲂与团头鲂IGF-Ⅰ cDNA序列同源性为99．8％，氨基酸序列同源性为99．4％。由此可见三角鲂的遗传学特征与团头鲂非常相似。     

团头鲂 HSP70 cDNA 的克隆、序列分析以及热应激对其 mRNA 表达的影响

采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)分离、克隆出团头鲂(Megalobrama amblycephala)肝脏热休克蛋白70(HSP70)基因全长cDNA序列,共2 224 bp,包括135 bp5'非翻译区、1 932 bp阅读框以及157 bp 3'非翻泽区[不包括Poly(A)].阅读框共编码643个氨基酸,分子量计算值为70.53 kD,理论等电点为5.25.该HSP70基因在翻译区不含内含子,符合诱导型HSP70的特征.团头鲂HSP70氨基酸序列中含有HSP70家族的3个签名序列以及细胞质特异性调控基序EEVD等.同源性分析表明,团头鲂HSP70氨基酸序列与斑马鱼等脊椎动物的相似性高达84.0%以上,与无脊椎动物果蝇的相似性也高达73.4%.生物信息学分析显示,团头鲂HSPTO基因所编码的蛋白质以亲水性区域为主,具有丰富的B细胞抗原位点,无信号肽,无跨膜区域,为非分泌型蛋白;同时还含有众多的蛋白激酶C磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,推测其可能在细胞信号转导与调控中发挥重要作用.该蛋白含有2个部分重叠的双向核定位序列,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,空间结构包括N端ATPase功能域和C端多肽结合功能域.应用实时定量PCR研究高温(34℃)应激对团头鲂HSP70 mRNA表达的影响.结果表明,在热应激过程巾肝脏HSP70 mRNA水平呈先升高后下降的变化趋势,说明该基因的表达受热应激调控,本实验克隆的序列为诱导型HSP70 cDNA.