镜鲤脂肪酸延长酶5基因的克隆和表达分析

脂肪酸延长酶5(ELOVL5)是高不饱和脂肪酸(HUFA)合成的关键酶之一。为了研究鲤HUFA合成的能力和机制,本研究采用RT-PCR和RACE技术获得镜鲤ELOVL5全长c DNA序列。ELOVL5基因c DNA全长1 121 bp,开放阅读框为876 bp,编码291个氨基酸。序列分析显示,镜鲤ELOVL5氨基酸序列包含1个组氨酸簇(HXXHH),1个典型的内质网驻留信号,多个跨膜区域和多个保守区域(KXXEXXDT、QXXFLHXYHH、NXXXHXXMYXYY、TXXQXXQ),具有典型的脂肪酸延长酶的结构特征。氨基酸同源性分析结果显示,镜鲤ELOVL5基因与其他鱼类同源性为79.0%~93.1%,与人同源性为69.0%。通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测该基因在镜鲤不同组织中的表达量,发现脂肪酸延长酶基因在镜鲤肝中表达量最高,其次为脑,在背部肌肉中表达量最低。镜鲤ELOVL5基因的获得为进一步研究镜鲤HUFA的合成途径及调控机理奠定了基础。     

鲤脂肪酸合成酶基因的克隆与表达分析

脂肪酸合成酶(FASN)是动物体内脂肪酸合成的关键酶。本研究利用逆转录PCR和RACE技术获得鲤Cyprinus carpio FASN全长cDNA序列为8 927bp,开放阅读框7 533bp,编码2 511个氨基酸。FASN蛋白质相对分子量274 145.67D,理论等电点(PI)为6.10。氨基酸同源性分析结果显示:鲤FASN基因与其他鱼类同源性为75.13%~95.34%,与人同源性为61.81%。系统进化树结果显示:鲤FASN氨基酸序列与金线鲃Sinocyclocheilus grahamia聚为一支,同源性最高。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测结果表明:FASN基因鲤脑组织中表达量最高,肝脏次之,血液中最低。鲤FASN基因的获得为进一步深入研究鲤脂肪酸的合成途径及脂肪发育分子调控机制奠定了基础。     

缺刻缘绿藻FAD基因的序列特征及其相对转录量对氮饥饿的响应

为探讨缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)花生四烯酸(20:4 6,AA)合成过程中一系列脂肪酸去饱和酶(FAD)的作用,本研究克隆了12、6及5 FAD基因的cDNA全长序列(GenBank登录号分别为JN205757、JN205755和JN205756)及其相应的DNA序列。它们的cDNA全长分别为1 806 bp、2 674 bp及2 318 bp,其中ORF长为1 137bp、1 443 bp和1 446 bp,分别编码由378、480和481个氨基酸组成的蛋白;通过其cDNA与DNA序列的比对,发现12、6及5 FAD基因分别具有4、5和7个内含子,其剪切位点均符合"GT-AG"规则。Δ12、Δ6和Δ5 FAD编码蛋白均富含疏水性氨基酸,约占各自氨基酸组成的52.8%、46.6%及50.9%。密码子的偏好性与缺刻缘绿藻其他基因保持一致。推测这3个FAD基因编码蛋白都存在4个跨膜区,而12和5 FAD还各有一个明显不跨膜的疏水区;都具有FAD家族各自相对保守的3个组氨酸簇基序。基于缺刻缘绿藻和其他物种相应的FAD基因编码蛋白序列所构建的Neighbor-joining(NJ)系统进化树,表明Δ12、Δ6、Δ5及ω3 FAD分别隶属于各自的分支,其中,Δ12与ω3 FAD的亲缘关系较近,而Δ6与Δ5 FAD具有较近的亲缘关系。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-RT-PCR)分析这3个FAD基因在缺刻缘绿藻缺氮培养96 h后又恢复氮培养72 h过程中的相对转录量,结果表明这3个基因的相对转录量都受到氮信号的调控,它们随着氮饥饿培养时间延长明显上升,而氮恢复培养后迅速并显著地下降到氮饥饿胁迫前的水平。结合已知脂肪酸成分在此过程中的变化,推测这3个基因对缺刻缘绿藻AA的合成和积累都起着重要的作用,而Δ6 FAD的作用可能更关键。     

岩原鲤MSTN基因克隆及饥饿对MSTN表达的影响

运用同源克隆的方法获得岩原鲤(Procypris rabaudi(Tchang))肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)c DNA全长序列,并通过逆转录PCR(RT-PCR)检测MSTN基因的组织差异性表达以及饥饿胁迫对MSTN基因表达的影响。结果显示,岩原鲤MSTN基因1 547 bp的c DNA序列,编码区为1 128 bp,编码375个氨基酸。PCR检测显示,该基因在肌肉和脑组织中大量表达,在眼、肠、心、鳃、肾和头肾组织中少量表达,在肝胰脏、脾脏组织中未见表达。饥饿再投喂实验表明肌肉组织中MSTN基因表达含量随着饥饿时间的延长逐渐升高,恢复投喂后3d表达含量急剧下降,投饵后6 d升至正常水平。结果表明,MSTN的表达对营养摄入敏感,在饥饿状态下岩原鲤通过上调MSTM表达来抑制肌肉生长,节约能量消耗。     

日本鳗鲡脂肪酸去饱和酶和延长酶基因的克隆与分析

利用RT—PCR和RACE方法克隆得到日本鳗鲡（Anguilla japonica）肝脏中控制高不饱和脂肪酸（highly unsaturated fatty acids，HUFA）合成的脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase，FAD）和脂肪酸延长酶（fatty acid elongase，ELO）全长cDNA序列。结果表明，2456bp的FAD全长cDNA序列含长达1046bp的3’-UTR、75bp的5’-UTR和编码444个氨基酸的长1335bp的阅读框。编码的蛋白序列含有FAD全部的特征结构区，包括3个组氨酸簇、2个跨膜区和1个细胞色素h5结构域，与其他具有不同生活史鱼类的FAD氨基酸序列具有70．5％～77．5％的同源性；分析显示其在系统树中与溯河洄游鱼类的亲缘关系最近。克隆得到的ELO全长cDNA序列长1239bp，含有885bp的开放阅读框，编码294个氨基酸，该蛋白序列含有单一的氧化还原中心组氨酸簇、内质网停留信号和多个跨膜区等ELO特征结构，与其他鱼类ELO氨基酸具有87．1％～88．8％的同源性；其在系统树中与北非鲶鱼（Clarias gariepinus）和斑马鱼亲缘关系较近。日本鳗鲡FAD和ELOcDNA全序列的获得为今后进一步研究其体内高不饱和脂肪酸合成途径及阐明该途径在不同鱼类中的分子进化机理奠定基础。     

鲤PPARγ基因序列特征及其与脂肪沉积的相关性

为探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor,PPARγ)对鲤（Cyprinus carpio）脂肪沉积的调控机制,采用RACE和实时荧光定量PCR技术克隆体质量（215.20±8.21）g鲤的PPARγ基因,分析其组织表达特征。结果显示,PPARγ基因c DNA全长为3 077 bp,包括233 bp的5′非编码区、1 311bp的3′非编码区和编码510个氨基酸的开放阅读框。鲤PPARγ包括4个功能结构域,即A/B区,DNA结合区（DNA binding domain,DBD区）,铰链区和配体结合区（ligand binding domain,LBD区）。鲤PPARγ与鲫（Carassius auratus）、斑马鱼（Danio rerio）的氨基酸序列相似性最高,分别为98.63%和87.28%。PPARγ基因在各组织均有表达,肝脏中相对表达量最高,脑次之,脾和心脏中最少。腹腔脂肪中PPARγ基因表达量多脂鲤显著高于少脂鲤（P<0.05）,背部肌肉中PPARγ基因表达量多脂鲤极显著高于少脂鲤（P&l...     

中华绒螯蟹FAD6-b基因的全长克隆及原核表达分析

根据已登录的中华绒螯蟹一种Δ6去饱和酶基因(Accession Number:JX946434)及菁夜蛾去饱和酶基因(Accession Number:KJ622055.1)的保守区设计引物,通过逆转录PCR以及RACE技术克隆了中华绒螯蟹另一种Δ6去饱和酶基因FAD6-b的全长序列。经序列分析,中华绒螯蟹FAD6-b cDNA全长为2 310 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 326 bp,共编码442个氨基酸(Accession Number:KP876058),理论分子量为50.86 ku,理论等电点为8.47,FAD6-b基因的氨基酸序列与已公布的一条中华绒螯蟹Δ6去饱和酶基因的一致性为76%。原核表达载体构建及其表达实验表明,中华绒螯蟹FAD6-b基因成功重组到原核表达载体pCold-TF DNA中,重组质粒pCold TF-fad6b在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,经SDS-PAGE电泳分析表明,IPTG诱导后的重组菌出现了单一的蛋白条带,且大小与预期(105.86 ku)一致,可溶性分析显示目的蛋白主要存在于蛋白上清液中。对重组蛋白进行纯化,蛋白纯化液经电泳检测后显示出特异性单一条带,进一步证明了pCold TF-fad6b的成功构建和表达。目的蛋白经Western-blotting检测,结果表明获得的重组蛋白与6×His抗体进行了特异性结合,显示出良好的免疫学活性。     

兴国红鲤AR基因的鉴定及MT暴露对幼鱼肝中AR和vtg表达的影响

实验克隆了兴国红鲤(Cyprinus carpio var singuonensis)雄激素受体(androgen receptor,AR)基因的全长c DNA序列和卵黄蛋白原(vitellogenin,vtg)基因的部分c DNA序列,并对雌性个体组织及甲基睾丸酮(Methyltestosterone,MT)暴露下幼鱼肝胰腺(以下简称:肝)中AR和vtg的表达进行检测。兴国红鲤AR基因c DNA全长3 229 bp,包括104 bp的5'非编码区(untranslation region,UTR)、编码846个氨基酸的2 541 bp开放阅读框(open reading frame,ORF)和485 bp 3'UTR。氨基酸序列同源性分析表明,兴国红鲤AR与其他鲤科鱼类AR的同源性较高。组织表达特征研究表明,AR在雌性个体的肝、卵巢、中肾、肌肉和端脑中有表达,其中肝中的表达量最高;vtg主要在肝、端脑和鳃中表达。兴国红鲤幼鱼在50μg/L的MT中暴露4周后,采用qRT-PCR检测了肝中AR和vtg的表达情况。在处理第1、2周,AR的表达受到一定的抑制,而在第3、4周其表达量升高,但其表达无显著性变化;而vtg的表达量在第3、4周均有极显著的升高。     

缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的特性及在氮饥饿过程中相对转录量的分析

根据莱茵衣藻和普通小球藻ω3脂肪酸去饱和酶氨基酸序列(GenBank登录号分别为ABL09485和BAB78717)的保守区(TMFWALF和HHDIGTH)设计简并引物,以缺刻缘绿藻H4301总RNA为模板,通过反转录PCR和cDNA末端快速克隆技术(RACE),克隆了缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的cDNA全长序列(GenBank登录号:EU658930),它与莱茵衣藻的这个基因具有69%相似性。该基因cDNA序列长2330bp,其中5'-非翻译区长107bp;3'-非翻译区912bp,且具有明显的poly(A)尾巴;开放阅读框1311bp,编码一个436个氨基酸的蛋白质,分子量为49.06ku,等电点7.85;该基因编码的蛋白为膜结合蛋白,含有2个疏水区域和3个保守的组氨酸簇基序。将该基因的cDNA序列与其DNA序列比对后,发现该基因在其编码区存在6个内含子,剪切位点均符合GT-AG规则。实时荧光定量PCR结果显示,在氮饥饿培养过程中,缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的相对转录量在4h时可能因休克显著提高(P<0.05),然后开始下调,12h开始显著下降(P<0.05),并在20h降到最低(约为完全培...     

银鲫crh基因的克隆、组织表达谱及其对摄食的影响

为研究crh (Corticotropin-releasing hormone)基因对鱼类摄食的调控作用,首次克隆了银鲫(Carassius auratus gibelio) crh基因c DNA全长序列。运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测crh基因m RNA在不同组织的表达及餐前、餐后和禁食对其表达的影响。结果显示,银鲫crh基因的c DNA序列全长为920 bp,其中,5’-UTR为53 bp,3’-UTR为378 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为489 bp。推导银鲫crh基因的ORF区编码蛋白由162个氨基酸组成,其中,含有11个氨基酸的保守区,24个氨基酸的信号肽,41个氨基酸的成熟肽。氨基酸序列的多重比较分析显示,银鲫crh基因与金鱼(Carassiusauratus)的同源性为99%,与鲤(Cyprinuscarpio)的同源性为96%。荧光定量PCR表达分析显示,银鲫crh基因在下丘脑中的表达量最高,其次是端脑和心脏。crh基因的表达量在餐前与餐后没有显著变化(P0.05),在禁食第5天、第7天出现极显著降低(P0.01),而在复投喂后第9天、第11天出现极显著升高(P0.01)。以上结果显示,crh基因在银鲫摄食调控方面可能扮演着重要角色。     

鳜脂蛋白脂酶和肝脂酶基因结构与组织表达

为了研究鳜(Sinioerca chuatsi)脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HL)基因结构与功能关系,首先采用RT-PCR及RACE法,克隆得到鳜肝脏LPL与HL基因cDNA全序列.鳜肝脏LPL基因cDNA全长为2089 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 548 bp,编码515个氨基酸.鳜HL基因cDNA全长为1 964 bp,其中ORF为1 494 bp,编码497个氨基酸.进化树分析显示,鳜LPL与HL基因与其他脊椎动物的LPL、HL基因各自聚集成簇.对鳜基因组进行PCR获得鳜LPL与HL全基因组DNA序列,与其他脊椎动物基因结构相似,鳜LPL基因由10个外显子和9个内含子组成,全长7 392 bp;鳜HL基因南9个外显子和8个内含子组成,全长8 837 bp.应用Genome Walker方法在鳜克隆得到一段长为1 071 bp的LPL和一段长为2 173 bp的HL基因5'侧翼Ⅸ序列,并利用相关软件预测其中具有多个保守的顺式调控元件.组织表达研究显示与易患动脉粥样硬化的人类LPL不同,鳜LPL基因在所有被检测组织中均有表达:在脂肪组织中大量表达,其次是肝脏、脑、肠道、肌肉,在脾中表达量最低;而鳜HL基因的表达则与人类相似,只在肝脏中表达.本研究将为深入探讨机体脂质代谢调节机制以及LPL、HL在防治动脉粥样硬化中的作用奠定良好基础.     

斑节对虾细胞周期蛋白Y基因克隆与原核表达

为了研究细胞周期蛋白Y(cyclin Y)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的作用,从斑节对虾转录组数据中筛选获得cyclin Y基因部分序列,采用SMART-RACE方法克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白Y(Pm-cyclin Y)基因c DNA全序列。Pm-cyclin Y基因c DNA全长1576 bp,其中包含108 bp的5′非编码区(5′UTR)和439 bp的3′非编码区(3′UTR)以及1029 bp的开放阅读框(ORF),可编码342个氨基酸。生物信息学分析显示,其编码的氨基酸序列有1个保守的周期蛋白框(cyclin box)同源结构域(172~257 aa),预测的分子量约为37.6 k D,理论等电点6.64。实时定量PCR显示其m RNA在卵巢的表达量显著高于其他组织(P0.05);并且在卵巢5个不同发育期都有表达,在III期卵巢中的表达量最高。本研究通过原核表达方法对Pm-cyclin Y进行重组表达,为其蛋白质功能方面的研究奠定了基础。     

团头鲂铁蛋白基因的克隆及其在嗜水气单胞菌感染下的表达

利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆团头鲂Megalobrama amblycephala铁蛋白基因c DNA全长序列;同时研究经嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila攻毒后团头鲂肝组织中铁蛋白表达的变化,了解铁蛋白基因在团头鲂免疫应答中的作用。结果表明:团头鲂铁蛋白c DNA全长序列包括150bp的5’末端序列(untranslated region,UTR),270bp的3’UTR,以及522bp编码174个氨基酸的开放阅读框(open reading frame,ORF)。这些氨基酸序列同其他鱼类铁蛋白M链氨基酸序列同源性较高。团头鲂铁蛋白基因在5’非编码区核甘酸序列124~154的位置有个特殊的结构,即铁反应元件(iron response element,IRE)。荧光定量PCR分析表明:铁蛋白基因在团头鲂肌肉、心脏、鳃、肝胰脏、脑和肾脏等组织器官中都有表达,在肝胰脏的表达量最高,脑组织表达量最低。经嗜水气单胞菌急性感染后,团头鲂肝胰脏组织中铁蛋白基因表达量显著上调。上述结果表明:团头鲂铁蛋白M亚基在团头鲂免疫应答过程中起重要作用。     

军曹鱼△6脂肪酸去饱和酶的cDNA序列克隆与基因表达

为了研究海水鱼合成高度不饱和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acids,HUFAs)的关键酶,本研究克隆了军曹鱼(Rachycentron canadum)的△6脂肪酸去饱和酶的部分cDNA序列。根据GenBank已公布的其他鱼类的△6脂肪酸去饱和酶cDNA序列进行分析,设计了一对用于PCR扩增军曹鱼的△6脂肪酸去饱和酶基因保守序列的引物;然后以军曹鱼肝总RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出一段长度为743bp的片段,该片段经纯化后,连接至pMD18-T载体上进行测序。结果显示,该片段与欧洲狼鲈(Dicentrarchus labrax)△6脂肪酸去饱和酶基因的覆盖区同源性为90.4%,该蛋白结构含有2个组氨酸保守区(HDFGH和HFQHH)和2个跨膜结构域,具有典型的△6脂肪酸去饱和酶结构特点。通过荧光定量PCR(Real-time quantityPCR,RTQ-PCR)检测该基因在军曹鱼幼鱼不同组织中的表达量,发现△6脂肪酸去饱和酶基因在军曹鱼脑的表达量最高;其次是肝;再其次是心、肠、脾、肾、鳃;而肌肉和皮肤的表达量相对较低,在脂肪组织中没有检测到△6去饱和酶基因的表达。结论为,军曹鱼具有合成HUFAs的关键酶—△6脂肪酸去饱和酶,在其所有组织中以脑之含量最多。     

魁蚶过氧化氢酶基因克隆及表达分析

采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆出魁蚶过氧化氢酶(Sb CAT)基因c DNA全长序列,该基因全长为2181 bp,包括1431 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),96 bp的5'端非翻译区(UTR)和654 bp的3'-UTR。其中ORF编码477个氨基酸,预测分子量为54 ku,理论等电点为8.03。Sb CAT氨基酸序列与其他所选动物的氨基酸序列具有较高的相似性,其相似度为68%~96%,Sb CAT氨基酸具有CAT基因家族的特征性序列,包括CAT活性位点,1个亚铁血红素结合位点及3个催化位点残基。此外,Sb CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合位点。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测了Sb CAT的组织表达特征。结果显示,Sb CAT m RNA在所检测的6种组织中均有表达,在外套膜中表达量较高,在肝胰腺和红细胞中表达量较低。经鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后,鳗弧菌刺激组的外套膜表达量一直较低,其他组织均表现出先上升再下降的趋势。研究表明,Sb CAT可能在魁蚶免疫防御中发挥重要作用。     

中华绒螯蟹脂肪酸延长酶(ELOVL)基因全长cDNA 的克隆及其表达分析

根据脂肪酸延长酶保守区序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)脂肪酸延长酶(ELOVL)基因全长(Gen Bank登录号:KR005628)。分析ELOVL序列表明,该基因c DNA全长2089 bp,开放阅读框(ORF)长1065 bp(包含终止密码子),编码的354个氨基酸具有典型的延长酶特征:1个高度保守的氧化还原中心组氨酸簇HVIHH,多个保守区和多个跨膜区(KFTEFLDT、NTFVHIVMYVYY、TNFQMI)。经氨基酸同源性和系统发育树分析,中华绒螯蟹ELOVL预测氨基酸序列与顶切叶蚁(Acromyrmex echinatior)ELOVL氨基酸序列相似性最高,为59%;同时与家蝇(Musca domestica)聚为一支,进而与日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)等聚为一大支。通过实时荧光定量PCR技术研究ELOVL m RNA在中华绒螯蟹不同组织中的表达量,及投喂不同配合饲料后在可食部位组织中的表达情况。结果显示,ELOVL在各组织中均有表达,在肝胰腺和肠道中表达量最高,心脏中最低,其他组织中少量表达。养殖98 d后分析表明,卵巢和肝胰腺组织中ELOVL m RNA在SO饲料组中表达量最高,并且表达水平随着饲料中鱼油(富含n-3 PUFA)比例减少、豆油(缺少n-3 PUFA)比例增加而显著升高(P0.05);精巢组织中ELOVL m KNA表达量在SO饲料组中最高;肌肉组织中ELOVL m KNA表达水平较低,且各饲料组间表达量差异不显著(P0.05)。以上结果表明,中华绒螯蟹存在ELOVL基因,并且ELOVL的表达受饲料脂肪水平的影响,这为探究中华绒螯蟹自身合成HUFA途径及调节机制奠定了基础。     

淇河鲫肌肉生长抑制素基因的克隆与表达

肌肉生长抑制素(MSTN)是动物肌肉发育和生长过程中的负调控因子。为了明确淇河鲫MSTN基因序列及其在肌肉生长发育中的调控功能,本研究利用RACE方法克隆淇河鲫MSTN全长c DNA序列,q RT-PCR分析其在不同组织和胚胎发育阶段的表达情况。结果显示,淇河鲫MSTN c DNA序列全长2094 bp(no.KC851952.1),包含86 bp 5′非编码区、880 bp 3′非编码区和1128 bp开放阅读框,编码375个氨基酸残基,前22个氨基酸残基为信号肽,34~256位氨基酸残基为TGF-β前肽域,281~375是TGF-β结构域,具蛋白酶水解位点RIRR和C端生物活性区的9个保守半胱氨酸残基。蛋白同源分析发现淇河鲫MSTN与鲤形目鱼类相似性较高,与哺乳动物和鸟类的相似性最低。系统进化分析显示,淇河鲫MSTN与鲫、鲤、鳡等鲤科鱼类亲缘关系较近。实时定量PCR分析表明,淇河鲫MSTN基因在各个组织中均有表达,脑中表达量最高,其次为肌肉和肝脏,肠道表达量最低。淇河鲫胚胎发育的各阶段MSTN基因均有表达,受精卵表达量最高,其次为囊胚期,神经胚期表达量最低。推测MSTN与淇河鲫肌肉发育生长具有一定的相关性,可能参与"双背鲫"特征的形成。     

α-tubulin基因的克隆、生物信息学分析及其在仿刺参肠道再生过程中的表达模式

为了明确仿刺参α-微管蛋白(α-tubulin)基因的序列及结构信息,初步研究该基因在仿刺参肠道再生过程中的生物学功能,本研究利用转录组数据挖掘和c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆得到仿刺参α-tubulin基因的全长c DNA序列。结果表明,仿刺参α-tubulin基因c DNA全长为1641 bp,共编码453个氨基酸,经生物信息学分析发现,该基因的5'端非编码区为153 bp,3'端非编码区为126 bp,推算该基因所编码的蛋白质分子量为50.33 ku,等电点为4.89,属于亲水性非跨膜蛋白质,且氨基酸序列中含有微管蛋白特有的信号序列GGGTGSG。通过与13种已公布物种的α-tubulin氨基酸序列进行多重序列比对及系统进化分析,发现仿刺参α-tubulin蛋白的氨基酸序列与其他真核生物的α-tubulin蛋白序列具有非常高的保守性,与南极岩斑鳕α-tubulin相似性高达90%。采用实时定量PCR技术对α-tubulin基因在仿刺参肠组织再生不同时期的表达情况进行检测,结果显示α-tubulin基因在仿刺参肠组织再生不同时期均有表达,其相对表达量在肠组织再生17 d时最高,5 d时最低。本研究在获得仿刺参α-tubulin基因结构信息的同时,进一步印证了真核生物α-tubulin基因的高度保守性,同时表明α-tubulin基因参与仿刺参肠道再生过程。     

剑尾鱼卵黄蛋白原C(Vg C)全长cDNA的克隆及表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法,克隆获得剑尾鱼卵黄蛋白原C(Vg C)基因的全长cDNA序列。剑尾鱼Vg C基因cDNA序列全长4 011 bp,其5′非编码区包含12 bp和3′非编码区包含246 bp;含有一个3 753 bp的开放阅读框(ORF),编码1 250个氨基酸,推测其编码氨基酸分子量大小为141.7 ku,编码氨基酸序列与其他鱼类卵黄白原C编码氨基酸序列相似性在44%～85%。荧光定量PCR结果显示,Vg C在剑尾鱼肝脏中表达量最高,脾、肾、卵巢中有微量表达,脑、肌肉、鳃中几乎没有检测到表达;对不同时间暴露在雌激素中剑尾鱼肝脏进行实时荧光定量PCR表达分析的结果表明,Vg C在剑尾鱼肝脏中第5天表达量最高,随后降低,第9天后维持相对较低的表达量。研究首次克隆了剑尾鱼Vg C基因全长cDNA序列,并对Vg C在剑尾鱼体内表达组织器官分布及雌激素诱导后不同时间表达谱进行了初步研究,为剑尾鱼生殖生理及环境污染物监测应用等不同领域研究打下重要基础。     

三疣梭子蟹核受体基因HR38的克隆及其在蜕皮中的表达分析

采用RACE技术,克隆出三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)核受体基因HR38的c DNA全长,命名为PTHR38。该基因c DNA序列全长为2950 bp,5′和3′非编码区(UTR)长分别为101 bp和551 bp,开放阅读框(ORF)长2298 bp。推测编码765个氨基酸,预测分子量为84.2 k D,理论等电点为6.3。生物学分析预测,PTHR38基因编码的蛋白属于不稳定蛋白,不具有跨膜结构域。同源性分析表明,PTHR38基因编码的氨基酸序列与大型溞(Daphnia magna)的同源性最高。实时荧光定量分析表明,PTHR38基因在蜕皮周期的各个组织中均有差异表达,在眼柄中表达差异最大。去除单侧眼柄后,PTHR38的表达量在整体上呈现不同程度的上升趋势。