α-tubulin基因的克隆、生物信息学分析及其在仿刺参肠道再生过程中的表达模式

为了明确仿刺参α-微管蛋白(α-tubulin)基因的序列及结构信息,初步研究该基因在仿刺参肠道再生过程中的生物学功能,本研究利用转录组数据挖掘和c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆得到仿刺参α-tubulin基因的全长c DNA序列。结果表明,仿刺参α-tubulin基因c DNA全长为1641 bp,共编码453个氨基酸,经生物信息学分析发现,该基因的5'端非编码区为153 bp,3'端非编码区为126 bp,推算该基因所编码的蛋白质分子量为50.33 ku,等电点为4.89,属于亲水性非跨膜蛋白质,且氨基酸序列中含有微管蛋白特有的信号序列GGGTGSG。通过与13种已公布物种的α-tubulin氨基酸序列进行多重序列比对及系统进化分析,发现仿刺参α-tubulin蛋白的氨基酸序列与其他真核生物的α-tubulin蛋白序列具有非常高的保守性,与南极岩斑鳕α-tubulin相似性高达90%。采用实时定量PCR技术对α-tubulin基因在仿刺参肠组织再生不同时期的表达情况进行检测,结果显示α-tubulin基因在仿刺参肠组织再生不同时期均有表达,其相对表达量在肠组织再生17 d时最高,5 d时最低。本研究在获得仿刺参α-tubulin基因结构信息的同时,进一步印证了真核生物α-tubulin基因的高度保守性,同时表明α-tubulin基因参与仿刺参肠道再生过程。     

仿刺参3个地理群体ITS1序列变异及系统发生分析

利用核糖体DNA第一内转录间隔区(Internal transcribed spacer 1, ITS1)序列,对中国大连(CD)、朝鲜罗津( KN)和俄罗斯海参崴( RV)仿刺参Apostichopus japonicus 3个群体的遗传结构进行分析。结果表明：经PCR扩增、克隆测序,获得长度为517~519 bp、524 bp两种类型的ITS1核苷酸序列,平均G+C含量(64.5%)显著高于A+T含量(35.5%);在仿刺参30个个体61条序列中共检测到49个变异位点,多态位点比例为9.33%,其中有4个简约信息位点,共有40种基因型,群体共享基因型为2个;遗传多样性分析表明,3个群体的遗传多样性丰富;分子方差分析显示,88.65%的变异来自于群体内部,群体间遗传分化较弱或中度分化;根据群体间遗传距离进行的聚类分析发现, KN群体与RV群体的亲缘关系较近, CD群体与KN、 RV群体的亲缘关系较远。     

3个地理群体仿刺参D-loop序列的变异及系统发生分析

为研究中国大连(CD)、朝鲜罗津(KN)和俄罗斯海参崴(RV)3个仿刺参群体的遗传结构,实验采用PCR扩增和测序技术,对3个群体共计71头仿刺参的线粒体D-loop序列进行了分析。结果显示,D-loop序列长度为447~465 bp,平均A+T含量(59.2%)显著高于G+C含量;共检测到119个变异位点,多态位点比例为24.24%,其中简约信息位点为53个,共有40种基因型,群体共享基因型7个。遗传多样性参数分析显示,3个群体均显示出较丰富的遗传多样性;分子方差(AMOVA)分析表明,3个群体间遗传分化较弱或只有中度分化,且93.04%的变异来自群体内。CD群体与RV群体之间遗传距离最远,为0.042,KN群体与RV群体之间遗传距离最近,为0.037 4。将本研究所得序列结合GenBank中青岛(QD)和威海(WH)仿刺参的D-loop序列构建系统发育树,QD与WH仿刺参首先聚为一小支,然后与CD群体聚为一大支,KN群体与RV群体聚为独立一支,这一聚类方式符合地理隔离模式。     

刺参主要卵黄蛋白MYP1、MYP2在不同幼体发育阶段、成体组织及温度胁迫条件下的相对定量表达

为探讨温度胁迫对刺参基因表达的影响,从已构建的刺参耐寒基因筛选cDNA文库中选取差异基因主要卵黄蛋白(major yolk protein,MYP):MYP1和MYP2,利用实时荧光定量PCR研究了其在刺参胚胎发生和个体发育9个阶段(受精卵、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳幼体、大耳幼体、樽形幼体、五触手幼体和稚参)、成体7种组织(呼吸树、体腔液、肠、纵肌、体壁、雄性性腺和雌性性腺)、长时温度胁迫(20℃、4℃,30 d)和低温短时胁迫(7℃、4℃、1℃、-2℃,12 h)成体肠组织中的表达量。结果发现,MYP1和MYP2表达模式基本相同:(1)在胚胎发育阶段樽形幼体时期开始表达,随后的阶段持续表达,到稚参阶段表达量最高;(2)在7种组织中,肠中的表达量最高,在体腔液中基本不表达,其余组织中均有表达;(3)在长时(30 d)温度胁迫下,肠组织中MYP表达量由高到低依次为4℃、12℃、20℃,且在4℃的表达量为20℃的6倍左右;(4)在低温短时胁迫(1℃、-2℃,12 h)条件下,肠组织中MYP表达量受到显著抑制,约为常温条件下的一半。研究表明,MYP在刺参胚胎发育的樽形幼体阶段开始合成,成体合成部位主要为肠,水温过低会抑制其表达。     

基于微卫星标记的地理群体仿刺参遗传结构判别分析模型的建立

通过主成因判别分析法(discriminant analysis of principal component,DAPC)建立仿刺参个体水平地理亚群体来源的判别模型。实验运用了20个微卫星引物,对俄罗斯海参崴(RS)和中国大连两个亚群(CN1、CN2)3个仿刺参地理群体进行了产物扩增和标记分型,获得3个地理群体分子标记表型数据。开创性地运用主成因分析和判别分析法建立判别模型,以研究不同群体仿刺参个体水平上遗传背景及其群体来源。结果显示,运用20对微卫星引物在仿刺参不同地理群体中稳定扩增的136个等位基因位点数据建立的判别模型可以准确判别刺参个体的群体来源。用75%的原有数据集建立模型,剩余的25%数据对模型的准确度进行验证,3个群体时模型准确率大于80%,2个群体时模型准确性超过90%。传统的遗传多样性和遗传结构分析显示,刺参的3个地理群体间存在中度的遗传分化,且遗传距离较近(D1=0.18,D2=0.159)。传统分析方法和新方法结果良好的一致性表明,利用DAPC和微卫星等位基因信息建立的刺参地理群体判别模型,可以很好地用于未知遗传背景刺参种质的来源鉴别。