缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的特性及在氮饥饿过程中相对转录量的分析

根据莱茵衣藻和普通小球藻ω3脂肪酸去饱和酶氨基酸序列(GenBank登录号分别为ABL09485和BAB78717)的保守区(TMFWALF和HHDIGTH)设计简并引物,以缺刻缘绿藻H4301总RNA为模板,通过反转录PCR和cDNA末端快速克隆技术(RACE),克隆了缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的cDNA全长序列(GenBank登录号:EU658930),它与莱茵衣藻的这个基因具有69%相似性。该基因cDNA序列长2330bp,其中5'-非翻译区长107bp;3'-非翻译区912bp,且具有明显的poly(A)尾巴;开放阅读框1311bp,编码一个436个氨基酸的蛋白质,分子量为49.06ku,等电点7.85;该基因编码的蛋白为膜结合蛋白,含有2个疏水区域和3个保守的组氨酸簇基序。将该基因的cDNA序列与其DNA序列比对后,发现该基因在其编码区存在6个内含子,剪切位点均符合GT-AG规则。实时荧光定量PCR结果显示,在氮饥饿培养过程中,缺刻缘绿藻ω3脂肪酸去饱和酶基因的相对转录量在4h时可能因休克显著提高(P<0.05),然后开始下调,12h开始显著下降(P<0.05),并在20h降到最低(约为完全培...     

缺刻缘绿藻cDNA文库的构建

缺刻缘绿藻（Myrmecia incise）富含花生四烯酸（arachidonic acid，AA），是迄今为止所知道的花生四烯酸含量最高的藻类。采用Trizol法提取总RNA，然后按照Clontech公司的SMART cDNA文库构建的方法，构建了缺刻缘绿藻的cDNA文库，测得的原始文库滴度为6&#215;10^6pfu／mL，随机挑选文库的阳性单克隆进行PCR鉴定，扩增出的片段主要集中在0．5-1．5kb，平均插入片段长度约为1kb，文库的重组率达95．83％，说明本实验所构建的cDNA文库质量合格。     

缺刻缘绿藻cDNA文库的构建

缺刻缘绿藻（Myrmecia incise）富含花生四烯酸（arachidonic acid，AA），是迄今为止所知道的花生四烯酸含量最高的藻类。采用Trizol法提取总RNA，然后按照Clontech公司的SMART cDNA文库构建的方法，构建了缺刻缘绿藻的cDNA文库，测得的原始文库滴度为6&#215;10^6pfu／mL，随机挑选文库的阳性单克隆进行PCR鉴定，扩增出的片段主要集中在0．5-1．5kb，平均插入片段长度约为1kb，文库的重组率达95．83％，说明本实验所构建的cDNA文库质量合格。     

缺刻缘绿藻总RNA提取方法的比较研究

为了获得高质量的缺刻缘绿藻总RNA,采用CTAB法、TRIzol法和RNAplant法3种方法对该藻总RNA的提取效果进行比较分析。结果表明,采用CTAB法提取获得的总RNA产率最高,但因可能含有较多的蛋白质、多糖等杂质使得纯度最低;TRIzol法提取的总RNA纯度较CTAB法稍高,但产率最低,且仍含有DNA带;RNAplant法提取的总RNA电泳图清晰,OD260nm/OD280nm值为2.0,高于前2种方法,产率在2种方法之间,表明RNAplant法更适于缺刻缘绿藻总RNA的提取。对后者提取的总RNA,经反转录合成的cDNA产物大小在500 bp~2 kb,并能通过RT-PCR获得18 SrRNA基因的特异性片段,进一步说明利用RNAplant法可为基因克隆、表达分析等后续研究提供高质量的RNA。