鱼类生殖细胞移植的研究进展及应用前景

生殖细胞移植是指将供体的生殖细胞移植到同种或异种受体体内,供体生殖细胞嵌合到受体性腺,经过增殖、分化并最终发育为功能性配子的过程。作为辅助生殖技术,它不仅为珍稀濒危动物的繁育和保护提供了新途径,同时也为生殖干细胞的功能研究提供了有效手段。鱼类生殖细胞移植研究首先在模式鱼类斑马鱼中开展,经过十多年的发展,取得了一系列突破性的进展:主要包括先后建立了以胚胎、仔鱼和成鱼为受体的生殖细胞移植体系,精原和卵原干细胞的发现拓宽了供体生殖细胞的选择,受体的选择与制备方法的完善。该技术在缩短鱼类性成熟周期、性控育种、珍稀濒危鱼类保护等方面具有巨大的应用前景,已成功在多种淡水和海水鱼类中开展了研究和应用。本文结合作者的研究实践和经验,系统地梳理和总结了鱼类生殖细胞移植的研究进展,指出了该技术实践应用的关键问题,并探讨了其应用前景。     

达氏鳇幼鱼对6种蛋白质原料中营养物质的表观消化率

为了解达氏鳇(Huso dauricus)幼鱼对不同蛋白质原料的消化能力,以0.4%的二氧化钛(TiO2)为指示剂,分别将鱼粉、鸡肉粉、肉骨粉、羽毛粉、双低菜粕和玉米蛋白粉这6种蛋白质原料与基础饲料按照3∶7的比例配制试验饲料,测定达氏鳇幼鱼对这6种蛋白质原料中干物质、粗蛋白质、粗脂肪、总能和总氨基酸的表观消化率。试验选取初始体质量为(66.79±2.18) g的达氏鳇幼鱼420尾,随机分为7组,每组3个重复,每个重复放鱼20尾。基础饲料投喂2周后,开始用试验饲料投喂,试验饲料投喂1周后采用捞网收集成形的粪便,共收集10 d。结果表明:达氏鳇幼鱼对鱼粉、鸡肉粉、肉骨粉、羽毛粉、双低菜粕和玉米蛋白粉这6种蛋白质原料中干物质、粗蛋白质、粗脂肪、总能和氨基酸的表观消化率分别为54.79%～88.07%、73.62%～89.47%、99.80%～100.74%、66.64%～89.24%、51.27%～98.62%。在6种蛋白质原料中,粗脂肪的表观消化率均在99%以上,而干物质、粗蛋白质和总能表观消化率则以鱼粉和鸡肉粉较高,玉米蛋白粉和双低菜籽粕次之,肉骨粉和羽毛粉较差。其中,鱼粉的粗蛋白质表观消化率最高,为89.47%,显著高于其他蛋白质原料(P0.05);鸡肉粉次之,为81.14%,与肉骨粉、双低菜籽粕和玉米蛋白粉差异不显著(P0.05);羽毛粉的粗蛋白质表观消化率最低,为73.62%,与肉骨粉差异不显著(P0.05),与其他蛋白质原料差异显著(P0.05)。各蛋白质原料中总氨基酸的表观消化率与粗蛋白质的表观消化率的变化趋势基本一致。由此可知,对于达氏鳇幼鱼饲料,鱼粉是最佳的蛋白质来源,鸡肉粉、玉米蛋白粉和双低菜籽粕亦可以作为其优质的蛋白质来源,而羽毛粉和肉骨粉作为蛋白质来源时,要控制其在饲料中的用量。     

中华鲟piwil1基因的克隆表达特征研究

Piwi是鱼类配子发生和性腺发育的重要调控因子。本研究从中华鲟(Acipenser sinensis)性腺中克隆得到了piwi基因的全长c DNA序列,该序列长3 393 bp,开放阅读框为2 583 bp,编码860个氨基酸。氨基酸序列多重对比发现,该序列具有PAZ和PIWI保守结构域,与其他鱼类piwil具有较高同源性;系统进化分析显示,中华鲟piwil聚于piwil1分支;因此,所得序列为piwi-like 1基因,命名为Aspiwil1。荧光定量PCR研究表明,Aspiwil1为母源表达,且其表达量随着胚胎发育逐渐降低;Aspiwil1在性腺中大量表达,在脑组织中也有较低水平的表达。性腺组织切片RNA原位杂交结果表明,Aspiwil1仅在生殖细胞表达,且其杂交信号随着卵子发生逐渐增强、精子发生逐渐减弱。本研究为中华鲟配子发生过程中Aspiwil1的功能研究提供了基础。     

兴国红鲤AR基因的鉴定及MT暴露对幼鱼肝中AR和vtg表达的影响

实验克隆了兴国红鲤(Cyprinus carpio var singuonensis)雄激素受体(androgen receptor,AR)基因的全长c DNA序列和卵黄蛋白原(vitellogenin,vtg)基因的部分c DNA序列,并对雌性个体组织及甲基睾丸酮(Methyltestosterone,MT)暴露下幼鱼肝胰腺(以下简称:肝)中AR和vtg的表达进行检测。兴国红鲤AR基因c DNA全长3 229 bp,包括104 bp的5'非编码区(untranslation region,UTR)、编码846个氨基酸的2 541 bp开放阅读框(open reading frame,ORF)和485 bp 3'UTR。氨基酸序列同源性分析表明,兴国红鲤AR与其他鲤科鱼类AR的同源性较高。组织表达特征研究表明,AR在雌性个体的肝、卵巢、中肾、肌肉和端脑中有表达,其中肝中的表达量最高;vtg主要在肝、端脑和鳃中表达。兴国红鲤幼鱼在50μg/L的MT中暴露4周后,采用qRT-PCR检测了肝中AR和vtg的表达情况。在处理第1、2周,AR的表达受到一定的抑制,而在第3、4周其表达量升高,但其表达无显著性变化;而vtg的表达量在第3、4周均有极显著的升高。     

人工养殖下达氏鳇幼鱼肠道菌群组成分析

为了解达氏鳇肠道微生物组成特征,采集6尾喂养人工配制饲料4周的达氏鳇后肠内容物分别提取DNA,并利用16S r RNA V3-V4变异区扩增子高通量测序的方法分析达氏鳇幼鱼肠道微生物组成与多样性。结果显示:6个样本共获得541575条有效序列,73个操作分类单元(OTUs)。73个OTUs隶属于7个门,其绝对优势菌群在门、目、科、属分类水平上分别为厚壁菌门(98.253%)、梭菌目(98.216%)、梭菌科(98.137%)、狭义梭菌属(92.892%)。序列注释发现,梭菌属中绝大部分为具有降解糖类为短链脂肪酸功能的Clostridium colicanis。此外,还分布有少量的分节丝状菌(3.99%)、鲸杆菌属(1.22%)等菌群。     

达氏鲟实时荧光定量PCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是基因表达研究的常用方法，筛选达氏鲟（肌动蛋白（）、18S核糖体RNA（）共7个常用内参基因作为候选基因，利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4个软件分析这7个候选基因在达氏鲟成鱼不同组织和不同发育时期胚胎及性腺的表达稳定性。结果表明，7个候选内参基因的定量PCR引物均可获得特异性扩增产物和理想的扩增效率。在成鱼不同组织中，候选内参基因稳定性由高到低的顺序为18S rRNA > > GAPDH > -actin > ；在不同发育时期卵巢中，候选内参基因稳定性由高到低的顺序为 > ，而不同发育卵巢最稳定表达的内参基因是。本研究旨在为今后达氏鲟不同组织、不同发育时期胚胎及性腺的基因表达差异研究提供理论基础。     

中华卵索线虫与Bt混合使用防治棉铃虫的初步研究

棉铃虫是棉花的主要害虫之一,近年来由于长期使用化学农药防治,导致棉铃虫的抗药性逐年增强,防效不理想,而且因长期使用化学农药对环境造成了严重的污染。因此棉铃虫的生物防治就显得尤为重要。中华卵索线虫和Bt都是有效防治棉铃虫的生物制剂,但它们在防治棉铃虫时虽然各有优势,却都存在一定的局限性。中华卵索线虫感染棉铃虫后需一个星期才能造成棉铃虫死亡,且其体外培养技术尚未攻克,无法大批量生产。Bt虽然应用广泛,但使用时易受紫外线照射、光照、气温等环境条件的影响。而两种生防制剂混合使用可综合各自优点,互补不足,预期会有更好的…     

中华鲟促甲状腺激素β亚基基因（TSHβ）cDNA序列的克隆及其表达分析

【目的】克隆中华鲟(Acipenser sinesis)促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因,分析其序列特征和进化特征,研究其在中华鲟中的组织表达特征和不同年龄垂体中的差异表达,为中华鲟生长发育调控研究提供基础数据。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE),克隆中华鲟TSHβ,对其cDNA序列及其推导的氨基酸序列进行序列特征分析和系统发生分析;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,对TSHβ-mRNA在中华鲟肝、心、脾、性腺、肠、垂体、下丘脑、中脑、端脑、小脑和延脑等组织中的表达状况,以及在1,3,5龄中华鲟个体垂体中的表达差异进行研究。【结果】克隆获得TSHβ基因,该cDNA序列全长649bp,5′和3′端非编码区分别为142和75bp;开放阅读框432bp,编码143个氨基酸。TSHβ亚基成熟多肽含有12个半胱氨酸(Cys)和2个N连糖基化位点。氨基酸序列多重比对表明,中华鲟TSHβ与促滤泡激素β亚基和促黄体激素β亚基的一致性分别为36%和35%,但与糖蛋白激素α亚基的一致性约为10%。与其他脊椎动物的TSHβ氨基酸序列进行比对发现,中华鲟TSHβ亚基与西伯利亚鲟一致性最高(98%);与鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类的序列一致性分别约为44%,55%,56%和60%;脊椎动物TSHβ的Cys和N连糖基化位点位置高度保守。TSHβ亚基仅在中华鲟垂体中有表达;3龄雄性个体垂体中TSHβ的表达量约为1龄的9倍,3龄和5龄雌性个体垂体中的表达量均约为1龄的5倍左右。【结论】成功获得了中华鲟TSHβ亚基基因,该基因具有与其他动物TSHβ相似的结构和表达特征;雄性个体表达量高于雌性个体,其在中华鲟个体的生长发育过程中表达量上升。     

基于转录组测序的兴国红鲤微卫星标记筛选

采用Illumina高通量测序技术,对兴国红鲤(Cyprinus carpio var.singuonensis)垂体和性腺等组织进行转录组测序分析,筛选微卫星标记并分析其组成及特征。结果显示:共获得13 652个微卫星标记,对所得位点进行分类,单核苷酸重复类型占47.86%,二、三、四、五、六核苷酸重复类型所占比例分别为34.43%、16.32%、1.25%、0.12%以及0.02%。随机选取30个SSR位点进行PCR验证,有20对可以扩增出清晰稳定的条带。在24个兴国红鲤个体中对上述位点进行多态性分析,结果表明,具有多态性的微卫星引物为9对。不同位点得到的等位基因范围为2~4,平均等位基因数为3.111 1±0.993 8,观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)以及多态信息含量(PIC)平均值分别为0.597 2±0.233 2、0.539 7±0.178 0和0.467 2±0.172 1。9个微卫星位点中,有4个显著偏离哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)(P0.05)。Illumina高通量测序提供了一种直观、高效开发微卫星标记的方法,所选兴国红鲤群体遗传多样性维持较好。     

微量元素锌、硒及维生素E对雌性黄鳝生长及抗氧化能力的影响

本研究旨在探讨微量元素锌、硒及维生素E对雌性黄鳝(Monopterusalbus)生长、肌肉营养成分及肝脏抗氧化能力的影响。根据正交试验设计L9(3⁴)正交试验,3个因素分别设定3个浓度梯度(锌为20mg/kg、40mg/kg、60 mg/kg,硒为0.66 mg/kg、1.31 mg/kg、1.97 mg/kg,维生素E为170 mg/kg、270 mg/kg、370 mg/kg),制备9组等氮等能的饲料。挑选1350尾初始平均体重为(19.67±1.59) g的2冬龄雌性黄鳝,随机分为9组,每组3个重复,每个重复50尾鱼,养殖周期为12周。结果表明:(1) 0.66 mg/kg硒添加组黄鳝生长性能显著高于另外两个较高浓度硒添加组(P<0.05),而锌及维生素E添加不影响黄鳝的生长性能(P>0.05),试验组1即0.66 mg/kg硒、20 mg/kg锌、170mg/kg维生素E添加组雌鳝的生长性能最好,增重率及特定生长率分别为(115.04±8.71)%及(1.39±0.07)%/d;(2)维生素E是影响黄鳝肥满度的首要指标, 370 mg/kg维...