采用RAPD技术筛选马口鱼性别差异相关分子标记

选用SBSA和SBSB两组随机引物（各20条）分别对马口鱼卵巢DNA和精巢DNA进行RAPD扩增,并用1．5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果表明,在40条随机引物中,有11条引物可以扩增出明显的雌雄性别差异条带,条带范围以SBSA5、SBSA6、SBSA9、SBSA16、SBSA19、SBSA20、SBSB2、SBSB3、SBSB9、SBSB16、SBSB17为主。运用RAPD筛选获得马口鱼性别DNA标记将有助于了解其调控雌雄性别发生的差异基因,为进一步的遗传育种提供基础。     

三疣梭子蟹抗乳化病相关基因的初步研究

在梭子蟹疾病高发季节,从宁波市梅山岛养殖场分别采集了三疣梭子蟹幼蟹得乳化病即将死亡个体10只和健康个体8只,用RAPD技术对此18个个体的进行了检测.从加个随机引物中筛选出6个,对每只梭子蟹的DNA进行扩增.结果表明,每个引物扩增出2～8条清晰可辨且重复性强的条带,并在引物S96对2组蟹的检测结果中,从得病组里得到了1条分子量在847bp左右的特异性条带,进而推测此条带应与抗乳化病能力的强弱有关.     

杂交一代_尼罗罗非鱼_奥利亚罗非鱼_及其亲本基因组DNA的比较

采用RAPD技术,用20个随机引物对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交一代的精巢DNA进行扩增反应,发现引物OPZ-14和OPZ-18在尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼之间扩增出有差异的DNA片段,作为鉴定两种鱼的分子标记有较高可信度.对这两种鱼的杂交一代基因组DNA的RAPD扩增能获得足够的多态性,20个引物中有8个引物扩增出差异性产物,表明杂交一代基因杂合性增强,这是杂种优势得以形成的重要遗传物质基础之一.     

大黄鱼血液基因组DNA的提取及其效果

应用Sangon血液基因组DNA小量抽提试剂盒,提取大黄鱼血液组织的基因组DNA,并以所提取的DNA为模板进行RAPD扩增效果分析。结果显示,血液基因组DNA稳定性好、质量高,分子量大小在20kb左右;RAPD扩增条带清晰,能满足RAPD等一般分子实验对于模板DNA的质量要求。为大黄鱼的隔代连续研究和濒危鱼类分子实验所要求的活体基因组DNA的获得提供了一个可行的样本组织采集方法。     

蓝鳃太阳鱼F1—F3三个子代遗传多样性的RAPD分析

利用随机引物扩增多态DNA(RAPD)对吴江市水产养殖有限公司所采集的蓝鳃太阳鱼亲代、人工繁殖获得的F1-F3代各30尾个体进行遗传多样性分析.从60条随机引物中筛选出条带较好的16条引物进行扩增,共扩增出42个多态位点,多态位点比例为48.3％.三代群体的多态位点比例分别为48.4％、50.8％、45.7％.Shannon多样性指数分别为1.323、1.325、1.125.随着选育的进行,上述各项参数的计算值逐渐降低,反映出选育群体在遗传上逐渐得到纯化,基因型逐步趋向纯合、稳定,经进一步的选育可望获得较稳定的品系.     

1种快速鉴定金钱鱼遗传性别的方法

金钱鱼(Scatophagus argus)是我国东南沿海名优养殖鱼类, 具有 XY 性别决定系统, Dmrt1 是其性别决定候选基因。金钱鱼生长具有性别二态性, 雌鱼生长快于雄鱼。目前缺乏快速鉴定金钱鱼遗传性别的分子标记, 阻碍了其性别控制育种技术的建立。本研究以公布的金钱鱼基因组数据, 在 Dmrt1 附近设计多对标记引物, 并通过 PCR 扩增验证标记的性别特异性。其中, 标记引物 Dmrt1-Marker-4-F/R 在雌鱼中仅扩增出一条 593 bp X 染色体条带, 而在雄鱼中能扩增出 593 bp 和 693 bp 两条条带, 分别来自 X 和 Y 染色体, 表明该标记为共显性标记。利用该标记检测我国南海沿岸 3 个不同地理群体 213 尾金钱鱼的遗传性别与表型性别完全一致。此外, 快速 DNA 提取试剂盒提取的片段较短 DNA 样品也可用于该对标记引物准确鉴定遗传性别。本研究建立了一种快速、准确、经济可靠的金钱鱼遗传性别鉴定方法, 将旨为促进金钱鱼性别控制育种技术的建立, 并为金钱鱼性别决定与分化机制研究提供依据。     

剑尾鱼RW-H近交系的遗传结构分析

筛选31条随机引物对剑尾鱼的第8代近交RW-H系A、B、C3窝共11尾剑尾鱼个体基因组DNA进行RAPD扩增，计算近交系个体间及不同窝间的相似系数及遗传距离。结果筛选的31条引物共扩增出383条带，扩增片段的大小在0．2～3kb。其中多态性带30条，多态性带频率在0～58．33％，平均为7．83％。近交系剑尾鱼不同个体拥有相同条带的比率较高。计算得到近交系的平均相似系数(S)为0．9829(0．9716～0．9960)，平均等位基因频率(q)为0．8692，最低平均杂合率(H)为0．1308。同时，用5个微卫星标记对非选育剑尾鱼和近交系RW-H系的基因组进行分析，检测等位基因的个数和大小，结果5个微卫星座位在非选育剑尾鱼中显示为多态，而在近交系RW-H系除1个位点出现等位基因外，其余均为纯合子，计算得到近交系的平均遗传相似系数为0．9345，两种方法均证明近交RW-H系第8代剑尾鱼有较高的遗传纯合度。     

施氏鲟、西伯利亚鲟、达氏鳇及其杂交种种质鉴定方法的建立及其应用

以施氏鲟（Huso dauricus）为研究材料,分别从线粒体基因组及核基因组两个层面进行物种分子鉴定方法研究。在线粒体基因组层面,对3种鲟及未知鲟种类共计119个样品的D-Loop区进行测序,通过同源序列比对,构建NJ进化树、计算群体间遗传距离,以鉴定其中30尾未知种类。在核基因组层面,利用15对微卫星标记扩增3种鲟DNA,筛选出特异性标记Ls19和SX226。Ls19在施氏鲟中扩增出特异条带126 bp、130 bp,在西伯利亚鲟中扩增出特异条带139 bp、143 bp,在达氏鳇中扩增出特异条带124 bp、127 bp;SX226在施氏鲟中扩增出特异条带185 bp,在西伯利亚鲟中扩增出特异条带260 bp、273 bp、283 bp,在达氏鳇中扩增出特异条带180 bp、182 bp。通过特异条带对未知鲟进行鉴定,结果显示：30尾未知鲟种类中,有西伯利亚鲟17尾,施氏鲟1尾,达氏鳇1尾,达氏鳇×施氏鲟2尾,施氏鲟×达氏鳇1尾,施氏鲟×西伯利亚鲟8尾。结果表明,特异性微卫星引物Ls19和SX226可以应用于施氏鲟、西伯利亚鲟、达氏鳇的纯种及杂交种分子水平种质鉴定。     

平胸龟遗传多样性的RAPD分析

应用RAPD技术对平胸龟(Platysternon megacephalum Gay)的遗传多样性进行了分析,用27个随机引物对福建寿宁平胸龟21个个体的基因组DNA进行了PCR扩增,共扩增出5187条DNA片段,平均每个个体扩增出247条带。在检测到的247条带中,多态性条带为141条,多态性条带百分比为55.97%(25.0%~88.89%),条带大小在100bp~2000bp之间,21个个体间遗传距离为0.0972~0.3198,平均遗传距离为0.1750±0.0387,表明平胸龟具有较高的遗传多样性水平。采用类平均聚类法(NJTREE)构建了21个个体相互关系的分子聚类图,表明该地区平胸龟并没有形成种群的分化。     

曼氏无针乌贼遗传多样性的RAPD分析

用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)10个个体的遗传多样性进行了检测,从24个随机引物中筛选出10个,对每个曼氏无针乌贼的DNA进行扩增,结果表明,每个引物扩增出2～8条清晰可辨且重复性强的条带,10个引物共检测到48条清晰且重复性好的条带,相对分子质量在200～2 000 bp,其中多态位点为7个,占14.6%,平均杂合度H0为0.032.实验所得出的曼氏无针乌贼的遗传多样性是比较低的.由于缺乏历史资料和数据的比较,只依据本实验的结论不能断定究竟是过度捕捞还是环境破坏影响了曼氏无针乌贼的遗传多样性.     

大黄鱼性别特异SNP标记的开发与验证

大黄鱼是我国养殖量最大的海水经济鱼类,其雌鱼生长显著快于雄鱼,但两性的外部形态差异不明显,也没有异形性染色体,依靠传统方法无法对其活体准确进行生理性别和遗传性别的判别与鉴定,需要开发性别特异的分子标记。本研究从2尾雌鱼和2尾雄鱼、以及分别由50雌鱼与50尾雄鱼组成的2个混合样品的基因组重测序数据比较中筛选与性别显著关联的SNP位点,对其中11个位点分别设计引物在15尾雌鱼和15尾雄鱼中扩增出PCR产物进行Sanger测序验证,鉴定出1个与性别完全连锁的位点(SNP6,15尾雌鱼均为纯合、15尾雄鱼均为杂合)。然后,设计等位基因特异性PCR引物,其中包括2条雌性与雄性通用引物和1条雄性特异引物,在闽—粤东族与岱衢族大黄鱼合计近2 200个个体中进行扩增,结果在全部雌鱼中都只扩增出1个348 bp的条带,而在全部雄鱼中还扩增出1个194 bp的Y染色体特异条带,检出率达到100%。研究表明,大黄鱼属于XX♀-XY♂类型的性别决定。本研究鉴定出一个雄性特异SNP标记,并建立了一种新的大黄鱼遗传性别鉴定技术,为大黄鱼单性育种、基因组选择育种和性别决定分子机制研究提供了重要的技术手段。     

雅罗鱼亚科鱼类(鳡鱼、草鱼及赤眼鳟)的ISSR分子鉴定

用3个ISSR引物对同为雅罗鱼亚科鱼类的鳡鱼、草鱼及赤眼鳟进行简单重复序列区间扩增(ISSR)的遗传分析.试验发现:(1)3种鱼类的种间遗传相似度以鳡鱼与草鱼之间最高(0.7157),鳡鱼与赤眼鳟之间最低(0.3041);遗传分化系数(Gst)＞0.9,且鳡鱼与草鱼的遗传分化系数最大(0.9806);UPGMA系统树显示3种鱼类分为2支,鳡鱼与草鱼首先聚在一起,最后与赤眼鳟聚类.(2)3个引物均具有种的特异性扩增带.其中引物ISSR8扩增的1550 bp和760 bp带,引物ISSR62扩增的700 bp带,引物ISSR76扩增的790 bp带为赤眼鳟的特异性谱带;引物ISSR8扩增的2000 bp和1875 bp带,引物ISSR62扩增的1380 bp带,引物ISSR76扩增的1240 bp与520 bp带为鳡鱼与草鱼的共有特异性谱带;引物ISSR8扩增的1190 bp带为鳡鱼与赤眼鳟的共有特异性谱带;引物ISSR8扩增的1340 bp与1000 bp,引物ISSR76扩增的2000 bp带为草鱼与赤眼鳟的共有特异性谱带.结果表明,鳡鱼、草鱼及赤眼鳟的遗传差异显著,分类地位至少在种的水平上,这与3种鱼的形态分类在属的水平是一致的,同时揭示了鳡鱼与草鱼的亲缘关系较赤眼鳟与二者的亲缘关系近;找到了3个引物共17条ISSR种内特异性标记和种间共享标记,可用于分子辅助分类和种质鉴定.     

7种珍珠贝RAPD鉴别标记的初步研究

采用RAPD分子标记技术对珠母贝属的大珠母贝、珠母贝、黑珠母贝、白珠母贝、合浦珠母贝、长耳珠母贝和珍珠贝属的企鹅珍珠贝的基因组DNA的特异性遗传标记进行分析。从21个OPM和S系列中筛选出4个引物,共扩增出57个位点,每条引物平均产生14·3个位点。扩增片段大小在250~2000bp间,平均每种贝每条引物产生4·9条带。其中引物S10对7种珍珠贝的RAPD产物呈现出物种的特异性,可同时将7种珍珠贝分开,其余引物可以将2种或2种以上的珍珠贝区别开来。引物S10可以作为种间鉴定的标记。     

青岛文昌鱼遗传多样性的RAPD分析

采用RAPD技术对青岛文昌鱼雌、雄各11条个体共22个样本进行遗传多样性检测。从40个寡聚核苷酸随机引物中筛选出17个扩增重复性好、条带清晰、特异性强的引物，对每个个体基因组DNA进行了扩增。得到RAPD产物的分子量在200～2200bp之间，产物总计127个位点，其中，多态位点60个(占47．24％)。计算个体间遗传相似系数平均为0．8656，个体间遗传距离平均为0．1344。用Shannon多样性指数量化的遗传多态度(Ho)，雄性群体(0．1912)高于雌性群体(0．1125)，平均遗传多态度(Hpop)为0．1519。文昌鱼遗传多态度所占的比例在群体内为0．2553，而雌、雄群体间为0．7447。在文昌鱼雌、雄个体RAPD产物中，两个电泳图谱上能读出明显的雄性特征带，估计可能与雄性文昌鱼具有异型性染色体有关，这与XY型性别决定机制相吻合。引物OPC12扩增产物250bp为雄性文昌鱼所特有，可能为区别性别的分子标记。用NJ法进行聚类分析，结果表明，22个个体明显按性剐聚成两类，文昌鱼雌、雄个体基因组间的差异较大。     

长江口刀鲚遗传多样性的随机扩增多态DNA(RAPD)分析

用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对长江口刀鲚(Coilia ectenes)30个个体的遗传多样性进行了检测，从40个随机引物中筛选出17个对每个刀鲚的DNA进行扩增，结果表明，17个引物共检测到148条清晰且重复性好的条带，分子量在200～2000bp之间，其中多态位点为86个，占58．11％；群体的Shannon多样性指数为0．1905，Nei基因多样性指数为0．2280；个体间最大遗传距离为0.212，最小遗传距离为0．092。通过与其他鱼类的遗传多样性的研究结果比较可初步判断，刀鲚群体的遗传多样性比较丰富。     

鲮鱼DAF和DNA谱带的快速银染检测

利用20个高GC含量的8bp的随机引物开展野生鲮鱼(Cirrhina molitorella)DNA扩增指纹的研究，以建立鲮鱼13NA扩增指纹(DAF)技术，包括引物设计，PCR反应条件的设置。结果显示，13AF引物浓度相对较高，最佳引物浓度为3．5μmol/L。DAF引物pn-16(GCGACCTG)扩增表明，DAF有好的重复性，引物pn-16扩增特征性谱带可用于鉴定鲮鱼。DAF扩增产物可揭示鲮DNA的多态性。同时建立了DNA尿素-聚丙烯酰胺凝胶银染快速检测技术和最佳银染参数，银染检测大约需要1h，建立包括固定、漂洗、染色、显色、停显色的银染程序和尿素-聚丙烯酰胺凝胶湿法与干法的保存方法。     

鱼类环境DNA研究中通用引物的筛选验证

为了筛选一个通用性和适用性良好的能够运用于环境DNA(eDNA)研究的鱼类引物,从相关文献中选取了鱼类线粒体基因组部分片段的5对引物,分别对线粒体D-loop区、16S rRNA基因、COI基因以及Cytb基因部分片段进行扩增。对千岛湖48种鱼类基因组DNA进行扩增后比较发现,引物16s和COI均可以取得良好的扩增效果,通用性优于其他几对引物。引物16s的扩增产物经凝胶电泳检测均出现明亮的目的条带,引物COI则有3种鱼的条带经凝胶电泳检测亮度较暗。利用上述引物对环境样品eDNA扩增时发现,只有16s和COI的引物具有良好的扩增效果,能够得到明显单一的亮带。对该两种引物的PCR产物克隆后测序比对发现,16s的PCR产物均为千岛湖常见鱼类物种的基因片段,COI的PCR产物则为细菌COI基因的部分片段。综上,我们认为引物16s在通用性和适用性上都更为适合作为鱼类群落结构eDNA研究的通用引物。     

三种黄鳝RAPD分析的引物筛选

试验用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对黄鳝属中产自缅甸的山黄鳝、印度尼西亚的穴黄鳝及中国的黄鳝的混合DNA进行引物筛选。40条引物有35条引物扩增出多态性片段。35条引物共获得334个扩增片段,长度为250～5417bp。     

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本遗传变异的RAPD分析

在优化RAPD检测条件的基础上，从100个随机引物中筛选出60个扩增较好的引物对异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和湘江野鲤相互间扩增DNA片段的异同性进行比较研究。结果显示，60个引物共产生1554条带，单一引物扩增的DNA片段数在6～20条之间，片段大小在200～3500bp之间。遗传相似率分析表明，异源四倍体鲫鲤与其原始母本红鲫的相似率为69．41％，与其原始父本野鲤的相似率为64．47％，说明异源四倍体鲫鲤接受原始母本红鲫的遗传物质要多一些；而红鲫和野鲤之间的相似率为42．18％，说明两者的基因组成有较大的相似性，从分子水平证实了红鲫和野鲤的远缘杂交具有较大的亲和性。在分析中，还发现异源四倍体鲫鲤有4条非亲本带，非亲本带谱率达0．72％，这些非亲本带可以作为异源四倍体鲫鲤特异性的分子标记。     

异精雌核发育草鱼F1与普通草鱼的SCAR标记鉴别初报

以赤眼鳟生理失活精子诱导的雌核发育草鱼F1群体(CC)和与之母本同源的普通草鱼群体(PC)为材料,采用RAPD和SCAR分子标记相结合的技术,在100条RAPD随机引物扩增的16条有效引物中扩增筛选出7条群体差异条带,其中1条为异精雌核发育草鱼群体中特有,其余均表现为异精雌核发育草鱼群体缺失;对7条RAPD特异条带的回收中仅得到S32和S336的特异条带。经回收、克隆、测序后根据序列信息设计了4对SCAR引物,其中S336的2对SCAR引物在两群体间扩增出的条带一致,特异性消失;S32的2对SCAR引物能扩增出两群体间的特异条带;对S32-Scar1F/S32-Scar1R扩增出的SCAR标记S321643进行大样本检测结果表明:该标记在异精雌核发育草鱼群体中的出现频率为0(0/55),在普通草鱼群体中出现频率为76.7%(46/60)。