三种体色黄鳝的RAPD分析

采用20个随机引物对洞庭湖区三种不同体色的黄鳝群体(分别以A、B、C区分)进行随机扩增多态性DNA分析。结果12个引物的扩增效果良好,统计学分析表明,黄鳝A与黄鳝B的遗传距离较小(0 054107)且与A、B两个群体内的遗传距离(分别为0 045000、0 038217)相近,说明黄鳝A、B两个群体的遗传差异不明显;而黄鳝C与黄鳝A的遗传距离(0 123654)以及黄鳝C与黄鳝B的遗传距离(0 134074)均明显大于黄鳝A与黄鳝B的遗传距离,且由引物S326和S462扩增出的5条特异性谱带可以作为区分黄鳝C与黄鳝A、B两个群体的遗传标记,说明黄鳝C与黄鳝A、B两个群体之间遗传差异性十分明显。     

黄鳝微卫星引物筛选及其在保护遗传学上的应用

研究了远缘种鲤的微卫星引物对黄鳝的适用性。结果显示，31对鲤微卫星引物中有11对引物能对黄鳝DNA模饭扩增出特异性带谱。每对引物扩增的等位基因数在3～13个，平均每个位点有5．6个等位基因，显示了较高的多态性。其中引物P1最理想，其PCR扩增产物能区分来自湖南、广东和孟加拉3个不同地域的黄鳝种群。应用微卫星技术对3个不同地域的黄鳝基因组DNA多态性分析结果显示，湖南、广东和孟加拉黄鳝群体内平均相似率依次为95．5％，95.8％和93．5％，平均变异度依次为0．045，0．042，0．063。群体间的相似率及变异度分析显示：湖南黄鳝和广东黄鳝群体间平均相似率为91．0％，变异度为0．045；湖南黄鳝和孟加拉黄鳝群体间平均相似率和变异度分别为55．7％和0．443；广东黄鳝和孟加拉黄鳝群体间平均相似率和变异度分别为58．6％和0．414。综合微卫星分析结果、黄鳝的外形特征及地理位置，可以推测，广东黄鳝与湖南黄鳝为同一个生物种的不同地理种群，而孟加拉黄鳝为同属中另一个种。     

黄鳝脑芳香化酶基因cDNA的克隆及组织表达特异性分析

根据NCBI数据库报道的黄鳝芳香化酶基因的gDNA序列,设计了一对特异性引物.用Trizol试剂盒提取黄鳝脑总RNA,反转录获得cDNA第一条链,进行PCR扩增.扩增产物经过回收、连接、测序后得到了一条长1514 bp的芳香化酶基因cDNA序列.同源性比较表明该基因属于脑型P450aromB,与其他鱼类脑型P450aromB的同源性较高(>70%),与性腺型P450aromA的同源性较低(<60%),与自身性腺型芳香化酶同源性为59.5%.采用RT-PCR的方法对该基因在雄性黄鳝的各组织表达情况进行了分析,结果表明,该基因的转录本较高的表达于脑和精巢中,较低的在皮肤中表达,而在肝脏、心脏、小肠、肌肉等组织中没有检测到该基因的表达.     

合浦珠母贝3个养殖群体的RAPD分析

利用RAPD标记技术检测了广西省北海市、海南省三亚市、广东省深圳市等 3个地理种群养殖合浦珠母贝(Pinctadamartensii)基因组DNA的多态性 ,并对其遗传结构进行了初步分析。从 4 0个随机引物中筛选出 13个10bp引物 ,它们在 3种群中共扩增出了 14 0条DNA片段 ,3种群共有片段 16条 ,DNA片段数分别为 5 8、91和 71条 ,多态性位点比例分别为 4 1 4 % ,6 5 0 %和 5 8 4 %。遗传距离分析表明 ,广西种群与广东种群的亲缘关系较近 ,而与海南种群亲缘关系较远。 13个引物中 ,引物S11和S3 58扩增出的 3种群指纹图谱差异显著 ,可作为 3种群鉴定的分子标记。     

黄鳝血清转铁蛋白多克隆抗体的制备及检测

为实现黄鳝血清转铁蛋白基因的原核表达并制备其多克隆抗体,利用基因特异性引物从黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝转铁蛋白的C端序列,亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET/Tf-C重组表达载体;转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和层析技术纯化Tf-C蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA技术和组织蛋白印迹对制备的多克隆抗体进行检测。试验结果表明,成功构建pET/Tf-C原核表达载体,并实现了蛋白的表达和纯化;制备的多克隆抗体效价大于1∶25 600,并能特异性地识别来源于黄鳝不同组织的血清转铁蛋白。研究结果对黄鳝血清转铁蛋白功能的研究奠定了基础。     

鱼类环境DNA研究中通用引物的筛选验证

为了筛选一个通用性和适用性良好的能够运用于环境DNA(eDNA)研究的鱼类引物,从相关文献中选取了鱼类线粒体基因组部分片段的5对引物,分别对线粒体D-loop区、16S rRNA基因、COI基因以及Cytb基因部分片段进行扩增。对千岛湖48种鱼类基因组DNA进行扩增后比较发现,引物16s和COI均可以取得良好的扩增效果,通用性优于其他几对引物。引物16s的扩增产物经凝胶电泳检测均出现明亮的目的条带,引物COI则有3种鱼的条带经凝胶电泳检测亮度较暗。利用上述引物对环境样品eDNA扩增时发现,只有16s和COI的引物具有良好的扩增效果,能够得到明显单一的亮带。对该两种引物的PCR产物克隆后测序比对发现,16s的PCR产物均为千岛湖常见鱼类物种的基因片段,COI的PCR产物则为细菌COI基因的部分片段。综上,我们认为引物16s在通用性和适用性上都更为适合作为鱼类群落结构eDNA研究的通用引物。     

黄鳝ghrelin基因的克隆及分子特征分析

Ghrelin是联系生殖和能量代谢的重要桥梁信号分子,通过克隆黄鳝(Monopterus albus)的ghrelin基因并对其基因结构和功能进行了初步分析;运用c DNA末端快速扩增技术获得了黄鳝ghrelin基因的c DNA序列和DNA序列全长。结果表明,黄鳝ghrelin基因c DNA全长552 bp(Gen Bank accession no.JX122807),包括115 bp的5'端非编码区、324 bp的完整开放阅读框以及113 bp的3'端非编码区;DNA序列全长1323 bp,由3个内含子和4个外显子构成,内含子剪切位点具有典型识别核苷酸GT/AG,3个内含子分别为594 bp、84 bp和93 bp,4个外显子长度分别为229 bp、78 bp、112 bp和133 bp。氨基酸序列分析显示,ghrelin基因推导的Ghrelin蛋白前体原(propreghrelin)序列由26 aa的信号肽、19 aa的成熟肽以及C端氨基酸残基等构成;其中,成熟肽第3位为丝氨酸(Ser3),是Ghrelin的酰基化位点;C端氨基酸残基序列极可能包括与Ghrelin成熟肽功能相互拮抗的肥胖抑制素(Obestatin)。氨基酸的同源性及进化关系分析表明,黄鳝与某些鲈形目鱼类的蛋白前体原存在高度相似性,且在进化上黄鳝与较高级的鲈形目、鲽形目鱼类聚为一支。ghrelin基因结构及其蛋白质某些氨基酸残基序列的高度保守,预示着Ghrelin在脊椎动物中有着重要的生理功能与类似的作用机制。     

条纹斑竹鲨基因组的RAPD分析初报

利用１１种随机引物对５要条纹斑竹鲨基因进行了ＲＡＰＤ检测，结果表明，１１种引物在每个个体上扩增的ＤＮＡ片段总数在７７－８４之间，单个随机引物扩增的ＤＮＡ片段数目由至１１条不等，平均为７．５条ＤＮＡ片段，片段的大小在３００－２８００ｂｐ之间，个体之间的相似率在９０％以上。     

杂交一代_尼罗罗非鱼_奥利亚罗非鱼_及其亲本基因组DNA的比较

采用RAPD技术,用20个随机引物对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交一代的精巢DNA进行扩增反应,发现引物OPZ-14和OPZ-18在尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼之间扩增出有差异的DNA片段,作为鉴定两种鱼的分子标记有较高可信度.对这两种鱼的杂交一代基因组DNA的RAPD扩增能获得足够的多态性,20个引物中有8个引物扩增出差异性产物,表明杂交一代基因杂合性增强,这是杂种优势得以形成的重要遗传物质基础之一.     

用RAPD技术研究3种鳗鱼的种质鉴定

利用RAPD技术从32个随机引物中筛选出20个引物,对日本鳗(Anguillajaponicus)、欧洲鳗(Anguillaanguilla)和美洲鳗(Anguillarostrata)的DNA进行扩增,均得到1～13条大小不等的DNA片段,长度大部分在500～2300bp,其中14个引物共扩增出37个特异性标记,可用来区分这3种鳗鱼。日本鳗和欧洲鳗和美洲鳗种群内相似系数分别为0.885,0.717,0.686;种间遗传距离分别为:日本鳗和欧洲鳗0.747,日本鳗和美洲鳗0.668,欧洲鳗和美洲鳗0.211。这与形态学分析的结果相一致。     

7种珍珠贝RAPD鉴别标记的初步研究

采用RAPD分子标记技术对珠母贝属的大珠母贝、珠母贝、黑珠母贝、白珠母贝、合浦珠母贝、长耳珠母贝和珍珠贝属的企鹅珍珠贝的基因组DNA的特异性遗传标记进行分析。从21个OPM和S系列中筛选出4个引物,共扩增出57个位点,每条引物平均产生14·3个位点。扩增片段大小在250~2000bp间,平均每种贝每条引物产生4·9条带。其中引物S10对7种珍珠贝的RAPD产物呈现出物种的特异性,可同时将7种珍珠贝分开,其余引物可以将2种或2种以上的珍珠贝区别开来。引物S10可以作为种间鉴定的标记。     

牙鲆和大菱鲆养殖群体的分子标记和遗传变异

用１６个１０碱基随机引物对养殖牙鲆（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）和大菱鲆（Ａｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｍａｘｉｍｕｓ）进行基因组随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）遗传分析。发现：（１）多个引物具有种的特异性扩增带。其中引物Ｓ７扩增的６９０和１１６０ｂｐ带,引物Ｓ２扩增的６８０ｂｐ带为牙鲆的种的特异性谱带;而引物Ｓ７扩增的６５３和８８９ｂｐ带,引物Ｓ２扩增的６５０、８７０、９９０及１１     

七里海中华绒螯蟹遗传多样性的RAPD和ISSR分析

利用RAPD-PCR及ISSR-PCR两种分子标记技术,分析了七里海中华绒螯蟹第6代繁育群体的遗传多样性。用10个多态性高的RAPD引物对24个七里海中华绒螯蟹样本个体进行扩增,共检测出107个不同的扩增位点,扩增片段大小为300~2300bp。其中多态位点总数为66个,平均多态位点比例为61.32%,群体内香农-维纳多样性值为0.1714。用8个多态性高的ISSR引物对24个个体共检测到106个位点,扩增片段为200~1500bp。其中多态性位点79个,平均多态位点百分率为74.53%,群体内香农-维纳多样性值为0.1778。结果显示,该群体的多态位点比例和香农-维纳多样性值均较大,说明其有较丰富的遗传多样性,同时也说明RAPD和ISSR技术用于七里海中华绒螯蟹核基因组的遗传多样性分析,具有较高的检出率和灵敏度。     

5个尼罗罗非鱼群体遗传关系的ISSR分析

采用ISSR分子标记技术,对吉富尼罗罗非鱼群体(GF)、尼罗罗非鱼群体Ⅰ(NLⅠ)、尼罗罗非鱼群体Ⅱ(NLⅡ)、尼罗罗非鱼群体Ⅲ(NLⅢ)和尼罗罗非鱼群体Ⅳ(NLⅣ)的遗传多样性进行分析。用81个ISSR引物对5个尼罗罗非鱼群体进行扩增,15个ISSR引物获得多态片段。根据Nei’s遗传距离矩阵构建了5个尼罗罗非鱼群体的遗传关系树状图。UPGMA聚类图表明:NLⅢ群体和NLⅣ群体最先聚在一起;其次二者再与GF群体聚在一起;NLⅠ群体与NLⅡ群体聚在一起。分析结果显示:GF群体与其它4个罗非鱼群体区分较明显;用UBC835扩增的500 bp片段为GF所特有,可作为区别GF和其它尼罗罗非鱼的分子标记。     

基于转录组测序的圆口铜鱼SSR标记初步筛选及特征分析

分析圆口铜鱼(Coreius guichenoti)的遗传多样性,可为其人工繁殖家系鉴别、分子标记辅助育种及长江上游珍稀特有鱼类的种质资源保护提供理论依据和技术支撑。以室内循环水养殖的圆口铜鱼为研究对象,提取其肝脏RNA,通过Illumina HiSeq? 2000 高通量测序平台进行转录组测序,利用MISA软件对测序获得的unigene进行微卫星（SSR）位点挖掘和特征分析,设计SSR位点引物并进行验证。结果显示,圆口铜鱼转录组测序共获得80 688条 unigene,通过查找获得34 155个SSR位点,分布在25 947条序列上,发生率为32.2%。圆口铜鱼SSR中主要重复单元类型为单碱基和二碱基,其中A/T和AC/GT为优势单碱基和二碱基重复单元,占总SSR数量的57.2%和19.7%。SSR重复数在5~60次,其中有40.3%的SSR序列集中在11~15次;SSR序列长度变化显著,单碱基至六碱基重复类型的总体长度在11~101 bp,其中12~35 bp序列长度占78.8%。随机选取50个SSR位点合成引物对9尾圆口铜鱼样本进行PCR 扩增验证,可稳定扩增出目的条带的有40对引物,其中16对具有多态性,证明了通过转录组测序开发圆口铜鱼SSR标记的可行性。     

对虾抗病性状遗传标记的RAPD分析

对人工选育的第3代中国对虾和选育的第1代凡纳对虾进行个体人工感染WSSV后，选取感染WSSV十余天但仍健康的对虾为实验材料，用220个随机引物进行RAPD分析，得到抗病性状相关的特异性遗传标记99个。其中中国对虾抗病组特异性片段出现了18个，片段大小在460－2305bp之间；凡纳对虾抗病组特异性片段产生81个，片段大小在435－2287bp。77个引物在两种对虾的抗病组扩增出特异性遗传标记，其中有4个引物各获得了三个特异性片段，有13个引物各获得了两个特异性片段，其余61个引物各获得了1个特异性片段。     

3个不同地理群体黑鲷遗传变异的RAPD分析

利用RAPD技术对取自胶州湾(青岛)、台湾海峡(厦门)和北部湾(海南)3个天然群体的24尾黑鲷(Sparus macrocephalus)进行群体内与群体间的遗传变异分析.在事先优化的反应条件下,所使用的60个随机引物中,有28个引物扩增出清晰稳定的片段,共计200条,大小在200～2 500 bp,其中多态性片段135条(多态性片段的比例为67.50%).青岛、厦门和海南黑鲷群体内的遗传距离分别是0.106 8、0.093 9和0.120 6,相似系数为0.893 2、0.906 1和0.879 4;群体间的遗传距离分别是0.155 0、0.131 8和0.122 8,其中青岛和海南黑鲷群体间的遗传距离最大,青岛与厦门其次,厦门与海南最小.群体内与群体间都具有较高的遗传变异.用MEGA2.1软件的UPGMA程序和NJ程序进行聚类分析,厦门与海南群体首先聚在一起,其次是青岛群体,两者的结果相一致.     

(鱼央)属4种鱼SRY、SOX和HOX基因同源序列的PCR扩增分析

选用根据人类SRY基因HMG保守区序列、HMG-box序列以及HOX基因保守序列设计的3对引物,分别对白缘(Liobagrus marginatus)、大拟缘(Liobagrus marginatoidesW u(b ig))、小拟缘(Liobagrus margina-toidesW u(sm all))、黑尾(Liobagrus nigricauda)4种鱼的雌雄基因组进行了PCR扩增。结果在4种鱼的雌雄基因组中发现1个1 200 bp左右的SRY基因同源序列片段,3个分别为200 bp、500 bp和1 200 bp左右的SOX基因同源序列片段,2个分别为150 bp和200 bp左右的HOX基因同源序列片段。对结果进行分析显示:SRY、SOX和HOX基因同源序列在4种雌雄个体间和种间无性别特异性和种属特异性,并且在SRY和SOX基因同源序列中可能含有内含子。     

嗜水气单胞菌J-1株丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，设计和合成了一对引物，以嗜水气单胞菌AhJ—1的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到质粒载体pGEM—T中进行测序和分析，结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％，扩增片段编码343个氨基酸，推测的分子量为35700，计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为核酸疫苗的侯选基因片段。     

平胸龟遗传多样性的RAPD分析

应用RAPD技术对平胸龟(Platysternon megacephalum Gay)的遗传多样性进行了分析,用27个随机引物对福建寿宁平胸龟21个个体的基因组DNA进行了PCR扩增,共扩增出5187条DNA片段,平均每个个体扩增出247条带。在检测到的247条带中,多态性条带为141条,多态性条带百分比为55.97%(25.0%~88.89%),条带大小在100bp~2000bp之间,21个个体间遗传距离为0.0972~0.3198,平均遗传距离为0.1750±0.0387,表明平胸龟具有较高的遗传多样性水平。采用类平均聚类法(NJTREE)构建了21个个体相互关系的分子聚类图,表明该地区平胸龟并没有形成种群的分化。