鲵鱼消化道细菌群落结构及多样性初步研究

采用常规分离纯化与构建16S rDNA克隆文库相结合的方法对（鲵）鱼（Miichthys miiuy）消化道细菌多样性进行了初步研究.结果表明,（鲵）鱼消化道各部位可培养细菌的菌落数量从大到小依次为前肠＞幽门胃＞中肠＞后肠＞前胃＞后胃＞口咽腔,其中肠道部位菌落数量最多.分离细菌菌株主要为杆状细菌和革兰氏阴性菌,对其中的50株典型菌株进行分子鉴定,发现它们主要属于变形菌门的γ-变形菌纲（占52.7％）和β-变形菌纲（占36.8％）,以及厚壁菌门的芽孢杆菌纲（占10.5％）;不可培养细菌16S rDNA文库克隆子主要属于γ-变形菌纲、α-变形菌纲和脱铁杆菌纲,部分序列与已报道的物种相似性较低,说明消化道中可能存在新的有待开发的肠道菌株.     

16S rDNA克隆文库技术在活性污泥系统微生物组成分析中的应用

采用构建16S rDNA克隆文库方法对活性污泥系统的细菌种群多样性进行研究。随机测定了71个克隆子序列(1 500bp),BLAST比对结果表明,活性污泥中微生物群落具有高度多样性,可分为6个主要类群,其中,拟杆菌(Bacteroides)类群和γ变形菌(γ-Proteobacteria)类群在文库中所占比例最大,分别为38.03%和32.39%;其次是β-Proteobacteria,占19.72%;Firmicutes,Candidate division TM7和α-Pro-teobacteria类群所占比例相对较小,分别为4.23%,4.23%和1.04%。序列分析结果表明,活性污泥中具有可强化生物脱氮除磷效果的食酸菌(Acidovorax),包括假单胞菌(Pseudomonas),红环菌(Rhodocyclus)等细菌。     

中华鳖体表和体内菌群多样性分析

采用16S rDNA分析方法,分别提取中华鳖体表和体内细菌总DNA,以之为模板进行PCR扩增获得细菌16S rDNA基因片段,并构建16S rDNA克隆文库.从2个文库中分别随机选取100个重组克隆子,抽提重组质粒,用Hae Ⅲ和MspⅠ限制性内切酶进行酶切,获得酶切指纹图谱,从每种图谱随机挑选克隆子测序,获得其16S rDNA部分序列,构建了系统进化树.在中华鳖体表和体内细菌克隆文库中分别包含13种和10种RFLP谱型,分别挑选了70个和60个克隆子进行测序.结果表明,中华鳖体表和体内文库克隆子分别归为15类和11类OTU,体表和体内菌群多样性较强,优势细菌类群分别为拟杆菌和变形菌,并在文库中检测到了几株益生菌和条件致病菌.     

摄食不同饵料的大口黑鲈肠道菌群分析

为了探究投喂冰鲜杂鱼和人工配合饲料对大口黑鲈肠道菌群的影响,本研究采用变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)对摄食不同饵料的2组鲈鱼肠道内容物的细菌群落结构进行了比较分析.结果显示,冰鲜组与饲料组的大口黑鲈肠道菌群组成相似性较低(相似性24％),且冰鲜组肠道菌群多样性高于饲料组.对2组大口黑鲈中共有条带和特异性条带进一步测序分析显示,2组大口黑鲈肠道共有菌有红螺菌、梭菌、保科爱德华菌、嗜麦芽窄食单胞菌和蓝细菌.冰鲜组大口黑鲈肠道中的特异性菌归属为拟杆菌、肉食杆菌、魏斯氏菌和邻单胞菌;饲料组大口黑鲈肠道中的特异性菌归属为黄杆菌、鲸杆菌、柠檬明串珠菌、缺陷短波单胞菌.研究表明,与投喂冰鲜杂鱼的大口黑鲈相比,人工配合饲料降低了大口黑鲈肠道菌群多样性,也抑制了拟杆菌等有益菌在大口黑鲈肠道内的分布.推测饲料组大口黑鲈生长较慢可能与其肠道菌群中拟杆菌与厚壁菌的比值下降有关.研究结果提示,在今后大口黑鲈养殖或者人工配合饲料研制过程中,添加拟杆菌等益生菌也许可促进大口黑鲈的生长和营养吸收.     

刺参消化道内含物细菌群落组成的PCR-DGGE分析

利用PCR-DGGE技术研究刺参(Apostichopus japonicus)前肠、中肠和后肠内含物的细菌群落组成。通过软件Bio-rad Quantity one分析DGGE指纹图谱,发现刺参后肠内含物的条带数目显著高于前肠和中肠(P=0.003,P=0.016),表明刺参后肠内含物的细菌多样性最高,其次是中肠;前肠内含物的细菌多样性最低。UPGMA聚类分析发现,不同刺参个体其后肠的细菌群落组成差异最小,前肠的细菌群落差异最大。经DGGE分离、条带切割和序列测定,共获得了13条序列,系统发育分析表明,刺参消化道内含物的细菌群落可主要归属于5大类群,即α-变形菌纲(α-proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)、δ-变形菌纲(δ-proteobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidetes)和柔膜菌纲(Mollicutes)。刺参前肠、中肠和后肠内含物的优势菌群均为γ-proteobacteria。Blast分析显示,其中12条与之亲缘关系最近的序列来自从海洋环境中获得的细菌克隆,表明刺参消化道的细菌群落可能直接或间接来源于刺参的栖息地环境。     

对两种不同投料方式的大黄鱼肠道菌群结构分析

为了解在不同投喂方式下大黄鱼的肠道微生态结构,研究采用高通量测序的方法对投喂冰鲜饲料和投喂颗粒饲料的大黄鱼的肠道菌群进行高通量测序,分析了肠道菌群结构差异。研究表明:变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)是大黄鱼肠道的主要菌群,其中变形菌门的丰度超过了30%;不同投喂组的大黄鱼肠道菌群结构存在一定差异,投喂冰鲜料组大黄鱼肠道内菌群OTUs和菌群的α多样性略低于投喂颗粒料的。     

浙南海水网箱主养鱼类配合饲料试验和推广探讨

为了在浙南海水网箱养殖中推广配合饲料,选择浙南海水网箱主养鱼类品种鲈鱼、大黄鱼、美国红鱼、黄姑鱼等进行配合饲料、冰鲜小杂鱼投喂养殖对比试验。试验结果:投喂冰鲜小杂鱼的饲料系数为8.22~10.21,投喂配合饲料的饲料系数为1.28~2.64;投喂配合饲料养成每千克鱼的平均饲料成本为18.63元,养成每千克鱼的总成本为25.64元;当小杂鱼的价格为每千克2.08元时,投喂小杂鱼和投喂配合饲料养殖每千克鱼的饲料成本相同,均为18.64元。试验结果表明,投喂配合饲料同样能养好海水鱼,冰鲜小杂鱼的价格是配合饲料推广的关键因素。     

青岛陆源排污口邻近海域异养细菌的组成与分布

对青岛近海度假区、港口区、养殖区、工业区4类排污口邻近海域异养细菌的组成与分布进行了调查研究,采用海洋异养细菌平板涂布培养法分离细菌,基于16S rDNA的扩增性DNA限制性酶切片段分析(ARDRA)进行聚类筛选并测序鉴定。结果显示,青岛排污口邻近海域可异养培养的菌株分布于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)4个细菌类群,变形菌门细菌数量占总测序数量的68%,其中γ-变形菌纲的数量在变形菌门中占88%;不同海域中细菌组成与分布有所不同,放线菌门和拟杆菌门的细菌种类较少且各海域分布有所不同,但γ-变形菌纲的弧菌属细菌(Vibrio sp.)在4类海域中均被发现,占总检测量的18.54%,其中溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)占弧菌总量的25%。不同海域也检测到V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.campbellii、V.parahaemolyticus等水产养殖业的潜在致病菌。根据16S rDNA系统进化关系和细菌门类聚类分析得到的结论推断,工业区与养殖区海域的细菌组成和分布相似度较高,推断各海域的细菌组成与排污口类型有一定相关性。     

大黄鱼微卫星标记的富集与筛选

根据生物素与链霉亲和素的亲和原理，采用生物素-磁珠富集微卫星，与传统放射性同位素杂交法相结合，构建筛选大黄鱼的微卫星文库。用生物素-微卫星捕捉单链限制性酶切片段（含有接头和大黄鱼微卫星序列），经PCR扩增单链目的片段形成双链，然后连接至T载体上，转化感受态细胞。将移至硝酸纤维素膜的重组菌用^32P标记的放射性同位素探针50[γ-^32P]ATP（CA）15筛选出阳性克隆菌。测序结果发现，阳性克隆率为71.9％，105个微卫星位点。其中选取设计合成30对并筛选出22对可用引物。说明所建大黄鱼微卫星文库是一个高质量的文库，可为大黄鱼基因组结构分析、大黄鱼精密微卫星连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究、分子标记辅助育种以及经济性状的QTL定位提供大量的微卫星标记。     

高蛋白配合饲料替代饲喂对拟穴青蟹肠道菌群的影响

为探明蟹公寓养殖模式下,高蛋白配合饲料替代杂鱼饲喂对拟穴青蟹菌群的影响,采用16S rRNA高通量测序技术,比较分析养殖过程中不同饵料组拟穴青蟹的肠道菌群结构。结果显示,各饵料组中优势菌群均为变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和拟杆菌门,占操作分类单元总数85.84%以上。不同饵料组共有细菌操作分类单元(695个)占总数的18.92%,其序列数占总序列数的95.39%。主坐标分析显示不同饵料组肠道菌群的群落结构未产生显著分化。共现性网络分析显示,随养殖过程推进,微生物互作网络复杂度降低。功能预测分析显示,细菌次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢等功能主要在养殖前期出现显著性差异,而养殖后期饵料组间无显著性差异。试验结果表明,蟹公寓养殖过程中,不同饵料会对拟穴青蟹的肠道菌群造成影响。与杂鱼组相比,高蛋白配合饲料在维持肠道菌群多样性方面有一定优势,同时未显著影响肠道细菌群落结构和功能。     

浒苔腐烂过程中水体细菌群落结构变化的PCR-DGGE分析

通过生态模拟实验,利用分子生态学技术,对浒苔(Enteromorpha prolifera)腐烂过程中水体细菌群落结构的变化进行了研究。将3.0 kg完全死亡的浒苔置于容积为500 L的实验容器中,定期取水样,进行化学需氧量(COD)、溶解氧(DO)、好氧性异养菌数量测定及细菌种群结构的分析。实验结果表明,随着浒苔腐烂程度的增加,水中的DO呈逐渐减少趋势,COD和好氧性异养菌数量均呈先增加后减少的变化趋势;水体细菌主要由拟杆菌门黄杆菌纲和变形菌门α-、γ-、ε-变形菌纲的细菌组成,其优势菌群在浒苔腐烂不同时期有较大程度的改变,初期黄杆菌纲细菌为主要优势细菌,后期则以α-、γ-、ε-变形菌纲细菌为主要优势细菌。本研究结果为研究浒苔爆发对海洋环境的影响提供了理论依据。     

养殖大黄鱼低温弧菌病病原的研究

浙江沿海深水网箱养殖大黄鱼冬天发生大量死亡，从病鱼体内分离出致病力较强的细菌GYC0227。人工感染试验证实这株菌为大黄鱼的病原菌。对细菌进行了形态、生理生化特性的测定，并进行了16S rRNA分子鉴定。PCR扩增获得了GYC0227菌株大小约1．5kb的16S rDNA部分基因片段，产物经回收纯化，克隆到pMD18-T载体，转化大肠杆菌TG1，对阳性克隆子进行酶切及PCR鉴定，并测序，将测定的序列递交NCBI进行BLAET同源序列比对，与溶藻弧菌的标准菌株的16S rDNA具有96％的同源性。结合菌株的生理生化特性，GYCD227菌株属于溶藻弧菌。该菌适应于低温生长，生长温度范围为7—25℃，并测定了其对14种药物的敏感性。     

湛江官渡近江牡蛎养殖水细菌群落的DGGE指纹分析

2011年3月-12月利用变性梯充凝胶电泳（denatured gradient gel elctrophoresis, DGGE）技术对湛江官渡地区近江特蛎（Crassostrea ariakensis）养殖水细菌群落花流水组成进行了监测研究。UPGAMA聚类分析显示3月-12月的样品细菌主要分属2大类群;多样性指数结果显示3月-7月细菌多样性高于8月-12月;系统发育分析显示牡蛎养殖区水体优势菌群主要由以下种群组成：未可培养的变形菌门（Proteobacteria）（α、γ、δ、ε）、未可培养的拟杆菌门（Bacterioidetes）、未可培养的疣微菌门（Verrucomicrobiae bacterium）、未可培养的放线菌门（Actinobacteria）和未可培养的蓝细菌门（Cyanobacter bacterium）。最优势菌群为α-变形菌纲和拟杆菌门的黄杆菌属（Flevobacterium）。     

不同养殖年份鱼塘底泥细菌群落多样性及演替分析

为探究不同养殖年份的鱼塘底泥中细菌多样性及演替关系,通过构建16S rRN A基因文库,比较分析养殖1年和养殖4年池塘底泥样品细菌的群落构成,分别由养殖1年和养殖4年文库获得145和172个克隆子,香农—威纳多样性指数分别为2．37和2．22,辛普森优势度指数分别为9．36和7．58,覆盖度指数分别为100％和93．3％。 Prolixibacter （34／145）、荚硫菌属（17／145）、浮霉菌属（15／145）和脱硫微菌属（12／145）为养殖1年样品优势菌群,长绳菌属（41／172）、Prolixibacter （31／172）、黄色单胞菌属（22／172）、Cetobacterium （21／172）和噬纤维菌属（15／172）为养殖4年样品优势菌群。养殖1年和养殖4年文库细菌菌群结构在种分类水平上的相似度系数为0．6171。由此可知,养殖池塘底泥中蕴含着复杂的微生物群落体系,长期的积累促使该微生物群落发生了演替。     

珠江河网冬季浮游细菌群落结构及其影响因素

为了解珠江河网冬季浮游细菌群落结构,探讨影响其群落结构的环境因素,于2017年11月和2018年1月在珠江河网(112.18°E～113.51°E,22.38°N～23.17°N)采集表层水样,借助IlluminaMiSeq高通量测序平台,运用16S rDNA扩增子技术研究珠江河网冬季浮游细菌群落结构,使用R(3.5.2)软件包以及SPSS进行统计分析及作图。结果表明,变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)是珠江河网丰度较高的门类,细菌群落优势种群依次为γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)和α-变形菌纲(α-Proteobacteria)。珠江河网冬季浮游细菌具有较高的菌群多样性(两次样品的Shannon指数分别为6.78±0.29、6.23±0.71), NMDS分析表明,浮游细菌群落结构之间不存在显著的地域差异。Pearson相关性分析表明,温度与γ-变形菌纲(P0.05)、放线菌纲(P0.05)以及α-变形菌纲(P0.01)的丰度显著正相关,pH与放线菌纲(P0.05)、α-变形菌纲(P0.01)的丰度以及多样性指数(Shannon:P0.01; Simpson:P0.01)显著负相关,溶解氧与α-变形菌纲的丰度显著负相关(P0.05)。冗余分析(RDA)结果显示,温度、pH是影响浮游细菌群落的主要因子。     

基于PCR-DGGE技术分析生物絮团的细菌群落结构

在草鱼养殖过程中添加碳源(葡萄糖)维持水体C∶N为20∶1以培养生物絮团,通过对生物絮团细菌群落构成进行种类鉴定来评价生物絮团中功能微生物的组成.采用PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术分析生物絮团形成第5、10和15天的细菌群落结构.DGGE指纹图谱结果分析表明:第5天和第10天的相似性最高,达67.4％;第5天和第15天相似性系数最低仅为40.5％.第10天时微生物多样性最高,第15天时多样性最低.对DGGE指纹图谱特征条带进行回收、克隆测序,结果表明,生物絮团培养过程主要微生物类群隶属于以下6个纲:α-变形菌纲( Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、β-变形菌纲( Betaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、拟杆菌纲(B acteroidetes),其中α-、β-及γ-变形菌占据主要位置.α-proteobacteria为3个阶段的共有优势菌,第5天时特异菌包括食酸菌属(Acidovorax)、气单胞菌属(Aeromonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium),第10天和15天分别为芽孢杆菌属(Bacillus)与红球菌属(Rhodococcus).研究首次发现,生物絮团应用于淡水养殖系统时细菌的组成和多样性都极其丰富,通过结合分析这些微生物的功能特点,为生物絮团技术在实际养殖生产中的进一步应用奠定基础.     

红鳍东方鲀稚鱼肠道可培养细菌的多样性

使用2216E平板涂布法从肠道样品分离可培养细菌,通过16S r DNA测序鉴定细菌。所有分离的细菌分为变形菌门(包含γ-变形细菌纲和α-变形细菌纲)和厚壁菌门。其中以γ-变形细菌纲为优势(83.3%)。在属的水平,从肠道中共分离出弧菌属、希瓦氏菌属、假交替单胞菌属、亚硫酸杆菌属、芽孢杆菌属、Aliivibrio、发光杆菌属、科尔韦尔氏菌属8个属,其中弧菌属、希瓦氏菌属和假交替单胞菌属的种类占总数的70%。首次发现亚硫酸杆菌属和科尔韦尔氏菌属作为红鳍东方鲀稚鱼肠道菌群的一部分。     

刺参龙须菜混养系统中细菌数量与群落组成

以刺参龙须菜混合养殖生态系统为研究对象,研究了系统中细菌数量的变化规律,沉积物中细菌群落结构和多样性的变化。结果表明,实验期间,刺参单养组及不同配比的刺参龙须菜混养组,围隔内底层水体中细菌数量均呈增高趋势,细菌数量在2.14×106～4.27×106cells/ml之间。不同刺参龙须菜配比的养殖系统内沉积物中的细菌数量在1.55×108～3.39×108cells/gdw之间,比水体中的细菌数量高两个数量级。DGGE图谱的UPGMA树状结构聚类分析图表明,不同取样时间(6月17日、7月7日)的沉积物细菌组成差异较大。系统发育分析表明,刺参龙须菜混养围隔内沉积物的优势细菌主要归属于拟杆菌纲(Bacteroidetes)、γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)、δ-变形菌纲(δ-pro-teobacteria)和α-变形菌纲(α-proteobacteria)。     

2种海洋饵料微藻藻际环境的细菌多样性研究

选取对数生长期的海洋饵料微藻——角毛藻(Chaetoceros sp.)和扁藻(Platymonas sp.)藻液,经无菌混合纤维素酯膜抽滤,获得游离和粘附的藻际细菌,并提取基因组DNA进行16S r DNA高通量测序,测序区间为16S r DNA的V3~V4可变区,测序结果经过数据质控获得有效序列数分别为44 222和40 721,用Uclust v1.1.579对序列进行OTU聚类,获得有效OTU数分别为3 747和3 809;用RDP classifier进行物种注释,分析藻际环境的细菌多样性。结果表明,2种微藻的藻际细菌主要分布于变形菌门(Proteobacteria)。角毛藻藻际细菌优势种群主要分布于γ-变形菌纲(34.3%)和α-变形菌纲(16.3%),扁藻藻际细菌优势种群主要分布于γ-变形菌纲(36.9%)、α-变形菌纲(17.7%)和β-变形菌纲(11.4%)。细菌群落Alpha多样性指数表明,角毛藻覆盖率为96.4%,香农指数为6.28,ACE指数为7 247.64,Chao1指数为6 046.91;扁藻覆盖率为98.0%,香农指数为5.99,ACE指数为7 166.06,Chao1指数为6 172.99。2藻种的藻际细菌群落内菌种均匀性和多样性相近。     

中华绒螯蟹生态育苗池塘细菌群落分析

为探究江苏省射阳地区沿海滩涂中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)生态育苗池塘细菌群落结构,分别对养殖池塘水体(S7,S8,S9)和池塘底泥(N7,N8,N9)细菌群落16SrDNA的V3、V4、V5可变区进行扩增,检测合格的文库进行高通量测序;利用Qiime(v1.7)软件,对序列阈值97%相似性水平进行聚类分析;分别以门、纲、目、科和属的分类水平对样本进行α-多样性指数分析;以Chaol指数和Shannon指数评估菌种丰富度和多样性。结果表明,3个生态育苗池塘得到OTU分别为8 881、7 406、8 566个。S7微生物归属于16门、29纲、58目、97科、191属;S8为9门、18纲、38目、68科、132属;S9为17门、32纲、60目、111科、227属。N7为41门、103纲、198目、325科、572属;N8为42门、103纲、203目、318科、534属;N9为40门、99纲、196目、323科、578属。养殖水体优势菌群以变形菌门(Proteobacteria)为主,其次是拟杆菌门(Bacteroidetes);池塘底泥优势菌群以变形菌门为主,其次为拟杆菌门、绿弯菌门(Chloroflexi)和浮霉菌门(Planctomycetes)。养殖池塘底泥中细菌群落的丰富度和物种多样性明显高于养殖水体,水体中细菌群落的丰富度S9S7S8,物种的多样性S7S9S8。池塘底泥中细菌群落的丰富度N7N9N8,物种的多样性N7 N9N8。