养殖大菱鲆出血病病原菌的分子生物学鉴定

对青岛某养殖场发病大菱鲆分离的5株病原菌进行鉴定。使用法国生物梅里埃公司的全自动微生物鉴定仪VITEK2Compact的革兰氏阴性菌鉴定卡(GNtest kit),结合生物梅里埃公司的API细菌鉴定系统API 20E进行生理生化反应测试。为了进一步确定5株菌的分类学地位,测定了16SrDNA基因序列,与相关细菌序列进行比对,构建了系统进化树。生化反应和16S rDNA基因序列表明其中4株菌与溶藻弧菌亲缘关系最近,人工感染试验表明溶藻弧菌对养殖大菱鲆的致病力是相当强的。     

杂色鲍幼苗“急性死亡脱落症”病原菌分析

从“急性死亡脱落症”发病期的杂色鲍幼苗体内和病苗附着的薄膜上，共分离到4株优势菌，即NA0301、NA0302、NA0303和NA0304。经人工浸泡感染实验证明，从病幼苗体内和苗附着的薄膜上分离到的优势菌株NA0301和NA0302是杂色鲍幼苗的致病菌，它们均为革兰氏阴性、短杆状、极生鞭毛，能运动。常规生理生化和Biolog细菌鉴定系统测试结果表明，菌株NA0301与溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）的亲缘关系最近，而菌株NA0302与溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的亲缘关系最近。为了进一步确定它们的分类学地位，分别测定了溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌的16S rDNA序列，分析相关细菌相应序列的同源性，并构建系统进化树。结果表明，菌株NA0301与溶珊瑚弧菌的亲缘关系最近，菌株NA0302与溶藻弧菌的亲缘关系最近。因此，菌株NA0301和菌株NA0302分别鉴定为：溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌。[中国水产科学，2006，13（4）：655—661]     

一株大黄鱼致病性溶藻弧菌的分离鉴定与毒力相关基因分析

2018年,宁德蕉城大湾渔排大黄鱼出现体表和鳍条溃疡、出血,鳃缺损等症状。为鉴定该菌株并评估其致病性,本研究从患病大黄鱼鳃部分离得到一株优势菌株,生理生化特征显示,该菌株可在TCBS培养基上生长,菌落颜色为黄色,为革兰阴性短杆菌,具有嗜盐性,生理生化指标与标准株17700一致。结合生理生化指标与16S rDNA分析,确定该菌为溶藻弧菌,命名为Val180620。攻毒结果显示,Val180620菌株对大黄鱼具有较强的致病力,在水温25℃腹腔注射感染时,对规格(20±2)g大黄鱼的LD_(50)为2.38×10~6 CFU。毒力相关基因分析结果表明,Val180620菌株携带有CollagenaseVA、ToxR、FlaA和TRH等毒力相关基因。此外,本研究未从菌株Val180620中检测出UreR基因,但菌株Val180620仍表现出较强的致病性,说明UreR不是决定溶藻弧菌毒力的主要因子。     

一株文蛤弧菌的筛选及鉴定

从发病的文蛤中筛选到1株菌株MP-1,对其进行了常规的生理生化鉴定及16SrDNA鉴定。从形态、生理生化、系统发育学、16SrDNA基因序列同源性等方面分析,菌株MP-1可以鉴定为弧菌属（Vibrio）溶藻弧菌,暂命名为Vibrio Alginolyticus.MP。     

罗氏沼虾致病性溶藻弧菌的鉴定及药敏分析

自广东省湛江市某养殖场患病的罗氏沼虾幼虾匀浆液内分离到一株优势菌QY170324,通过细菌微量生化鉴定管与16SrDNA序列分析对该株优势菌进行鉴定,并进行药敏特性分析和人工感染试验。结果显示,该菌嗜盐性,兼性厌氧,为革兰氏阴性弧菌,能利用蔗糖、甘露糖,赖氨酸脱羧酶、V-P试验均为阳性,在含3%、6%、8%、10%NaCl胨水中均能生长;根据其菌落形态观察、生理生化特性测定,结合《伯杰氏细菌鉴定手册》,鉴定该菌为溶藻弧菌。通过PCR扩增该菌的16SrDNA基因,经过测序及BLAST比对,菌侏OY170324与溶藻弧菌的同源性高达99%;经人工回归感染试验,该菌有较强的致病力。分离的溶藻弧菌QY170324对庆大霉素、四环素、哌拉西林、氧氟沙星、头孢他啶、复方新诺明等抗生素高度敏感,对头孢曲松、卡那霉素、新霉素、米诺环素、麦迪霉素、头孢唑林、多黏菌素B中度敏感,对克林霉素、羧苄西林、头孢氨苄耐药。     

养殖大黄鱼溶藻酸弧菌病病原菌传染途径的研究

从养殖大黄鱼病鱼的肝脏和脾脏内分离、纯化到溶藻酸弧菌，经回归感染试验证实它是该病的致病菌。使用法国生物一梅里埃公司生产的自动细菌鉴定仪(ATB)进行细菌鉴定，该菌株的生理生化特性符合溶藻酸弧菌的特性。研究结果表明，养殖大黄鱼溶藻酸弧菌病病原菌传染途径，主要是从水经伤口传染到体内，在试验条件下传染率为60％。病原菌在30℃时生长很快，20℃时生长慢，10℃时基本不生长，对氟苯尼考、四环素和乙酰螺旋霉素等7种药物敏感。     

网箱养殖大黄鱼假单胞菌病病原的分离与鉴定

浙江宁波、台州等地相继发生网箱养殖大黄鱼的大量死亡,主要症状为脾脏、肾脏有许多白色结节,大小为0.1～1mm。从病鱼体内分离出致病力极强的菌株GYCWS,人工感染试验证实为大黄鱼的病原菌,其半数致死量(LD50)为8.5×104CFU/ml。对该细菌进行了形态、生理生化特性的测定,并进行了全自动微生物分析系统(ID32GN)及16S rRNA分子鉴定。经PCR扩增获得了大小约1.5Kb的16S rRNA部分基因片段,产物经回收纯化,克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌TG1,对阳性克隆子进行酶切及PCR鉴定确认阳性重组质粒,将测定的序列递交NCBI进行BLAST同源序列比对,与恶臭假单胞菌的16S rRNA基因(DQ201403、AY785244)具有较高的同源性(99%),该序列在Genbank上的登录号为DQ648602。结合细菌的生理生化特性,GYCWS菌株属于恶臭假单胞菌(Pseudo monas putida)。药敏试验结果表明,病原菌GYCWS对卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那、氟派酸、四环素、链霉素药物敏感。     

养殖大菱鲆腹水症病原菌SR1的分离及鉴定

从患腹水症的养殖大菱鲆（Scophthalmus maximus）腹水分离到1株优势细菌SR1，人工感染实验证实其具有致病性。经API ID32E系统鉴定为溶藻弧菌（Viibrio alginolyticus），并测定了其16S rRNA基因序列和热激蛋白HSP60（Heat shock protein，HSP）基因序列。基于16S rRNA基因序列构建的系统树结果表明，菌株SR1与溶藻弧菌（AY967727）亲缘关系最近，然而置信度较低，仅有27％，不能有效地鉴定到种。HSP60基因序列分析表明，该菌株与溶藻弧菌（AF230931）同源性最高，为99．2％。系统发育树表明SR1确与溶藻弧菌（AF230931）聚为一个分支，且置信度较高，为84％。综合上述结果，菌株SR1可鉴定为溶藻弧菌。[中国水产科学，2006，13（4）：603—609]     

1株军曹鱼病原弧菌的鉴定及其系统发育树分析

从养殖的患病军曹鱼身上分离出1株病原菌JT2，革兰氏阴性，短杆状，有极生鞭毛，能运动，菌落半透明。经回归感染实验，证明该菌为军曹鱼病原菌。进行了常规生理生化实验，并用API-ID32E系统鉴定该菌。再经Biolog-GN细菌鉴定系统鉴定，结果JT2与鲨鱼弧菌（Vibrio carchariae）相似度最高。为了进一步确定该菌的分类学地位，测定了其16SrDNA序列，分析了相关细菌的同源性，构建其系统发育树。结果表明，该菌株与V．carchariae的亲缘关系最近。综合上述几种方法的鉴定结果，最后鉴定该株菌为鲨鱼弧菌V．carchariae。     

两株西施舌内脏团细菌的分离及初步鉴定

自健康西施舌内脏团中分离得到两株细菌,命名为NZT-1、NZT-2,并进行形态学观察、生理生化试验和16S rRNA基因分析.电镜观察结果显示,两株菌均为短杆状,革兰氏阴性;生化反应显示,菌株NZT-1为梅氏弧菌的概率为89.07％,NZT-2为梅氏弧菌的概率为66.21％,两菌株均产纤维素酶、蛋白质酶、右旋糖酐酶,NZT-1产淀粉酶;16S rRNA基因分析结果显示菌株NZT-1、NZT-2与弧菌属的EHP1菌株的核苷酸序列相似度分别为96％、95％,初步鉴定两株菌属弧菌属.生物学特性研究表明两株菌生长的最适pH范围为5.0～10.0,最适生长温度28℃.     

梭子蟹牙膏病病原菌——溶藻弧菌的鉴定及其系统发育分析

从山东潍坊池塘养殖的患有牙膏病的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)中分离到1株病原菌(PX25),经回接感染证实为该病的病原菌。经生理生化试验及形态结构观察显示,该菌株革兰氏阴性,短杆状,直或稍弯曲,两端钝圆;固体培养基上培养后进行染色具有周生侧毛,液体培养基中培养后进行鞭毛染色具一极生单鞭毛;悬滴法观察PX25菌株具有很强的运动性。对其16SrRNA基因进行PCR扩增、测序和系统发育分析。结果表明,该菌株与溶藻弧菌亲缘关系最近,相似性达99.35%。综合菌体在形态、生理生化、API20NE与API20E自动鉴定结果、16S rRNA同源性等方面的特性,确认PX25为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。     

克氏原螯虾副溶血弧菌的分离鉴定及药敏特性

为了净化水产养殖环境,减少克氏原螯虾(Procambarus clarkii)由于养殖规模不断扩大而感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)导致的大量死亡,寻求安全有效的防治措施,开展了克氏原螯虾副溶血弧菌的分离鉴定及药敏特性试验。2018年5月从湖北省公安县某养殖场采集到一批患病的克氏原螯虾,解剖后发现病虾的肝胰腺肿大发黄,肠道内无食物,有类似肠炎症状,从肝胰腺中分离出的致病菌经TCBS培养,得到光滑蔓延生长的菌落,呈蓝绿色斗笠状,菌落大小不一。显微观察发现细菌形态为棒状或弧状,长短不一,革兰氏染色呈红色,属于革兰氏阴性菌,细菌形态单一;通过分析其16S rDNA序列和生理生化特征,鉴定为副溶血弧菌并命名为Vp-2,其与弧菌属种类同源性最高,并与菌株Vibrio parahaemolyticus DQ068942.1的亲缘关系较近。通过纸片扩散法进行药敏试验,该菌株对氟苯尼考、卡那霉素、复方新诺明等7种抗生素敏感;对利福平、磺胺异恶唑、庆大霉素耐药。生理生化特性测定结果显示,菌株Vp-2的理化特性基本与标准菌株一致。人工回感试验表明,发病克氏原螯虾的症状与自然发病症状类似,解剖发现死亡的克氏原螯虾肝胰腺肿大发黄,肠道内有炎症现象,并从中分离到该菌。分离到的副溶血弧菌菌株对克氏原螯虾有致病性,生产中可用氟苯尼考、四环素等药物进行防治。     

1株鲢病原弧菌的分离鉴定

从养殖的患病鲢(Hypophthalmichthys molitrix)组织分离出1株病原菌CQWL002,革兰氏阴性,短杆状,菌落半透明。经回归感染试验,证明该菌为鲢的病原菌。用API系统结合常规生理生化实验对该菌进行初步鉴定。为了进一步确定该菌的分类学地位,测定了其16SrDNA序列,分析了相关细菌的同源性,构建其系统发育树。结果表明,该菌株与河流弧菌(Vibrio fluvialis)的亲缘关系最近。综合上述几种方法的鉴定结果,最后鉴定株菌CQWL002为河流弧菌。     

一株感染深水网箱养殖许氏平鲉的 病原菌分离与鉴定

2016年7月,山东省长岛县深水网箱养殖许氏平鲉(Sebastes schlegeli)暴发严重皮肤溃疡症。作者对病鱼进行病原菌分离。通过形态学观察、常规生理生化试验、gyrB和16S rDNA基因克隆测序等方法对分离菌株进行鉴定。在病灶溃疡处分离到一株绝对优势菌BZ01,该菌株在TSB固体培养基上呈半透明菌落,在TCBS选择性培养基上菌落呈绿色。透射电镜观察为短棒状,具有单根极生鞭毛。人工回接感染证明,该菌株对许氏平鲉具有较强的致病力,可以引起皮肤溃疡等症状,且与自然感染症状一致,其LD50为2.07×106 CFU/ml。通过gyrB和16S rDNA基因序列测定并构建系统发育树显示,菌株BZ01与弧菌属同源性最高,并在系统发育树中与轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)聚为一枝,结合形态及生理生化表型测定结果,将该菌株鉴定为轮虫弧菌(V. rotiferianus)。药敏试验结果显示,该菌株对四环素类、喹诺酮类、香豆素类、肽酰转移酶类高度敏感,而对大环内酯类、多肽类、磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类中度敏感或不敏感。     

一株感染深水网箱养殖许氏平鲉的病原菌分离与鉴定

2016年7月,山东省长岛县深水网箱养殖许氏平鲉(Sebastes schlegeli)暴发严重皮肤溃疡症。作者对病鱼进行病原菌分离。通过形态学观察、常规生理生化试验、gyrB和16S rDNA基因克隆测序等方法对分离菌株进行鉴定。在病灶溃疡处分离到一株绝对优势菌BZ01,该菌株在TSB固体培养基上呈半透明菌落,在TCBS选择性培养基上菌落呈绿色。透射电镜观察为短棒状,具有单根极生鞭毛。人工回接感染证明,该菌株对许氏平鲉具有较强的致病力,可以引起皮肤溃疡等症状,且与自然感染症状一致,其LD₅₀为2.07×10~6 CFU/ml。通过gyrB和16S rDNA基因序列测定并构建系统发育树显示,菌株BZ01与弧菌属同源性最高,并在系统发育树中与轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)聚为一枝,结合形态及生理生化表型测定结果,将该菌株鉴定为轮虫弧菌(V.rotiferianus)。药敏试验结果显示,该菌株对四环素类、喹诺酮类、香豆素类、肽酰转移酶类高度敏感,而对大环内酯类、多肽类、磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类中度敏感或不敏感。     

一株养殖沙塘鳢肠道溶血性苏云金芽孢杆菌的分离鉴定

为探究养殖沙塘鳢细菌病害,采集江苏省养殖沙塘鳢,分离内脏细菌,对从肠道分离到的一株细菌进行了鉴定。运用显微镜观察其形态,细菌纯培养进行生理生化指标鉴定,并通过16 S rDNA同源性分析等方法对该株细菌进行鉴定。结果表明,其形态特征及生理生化指标符合蜡状芽孢杆菌的特点,GeneBank中同源系列检索结果显示,该菌与苏云金芽孢杆菌的16 S rDNA序列同源性高达99%,系统发育树表明该菌为苏云金芽孢杆菌。     

不同环境条件对溶藻弧菌粘附大黄鱼肠粘液的影响

研究了不同环境条件下溶藻弧菌对大黄鱼肠粘液的粘附作用。采用细菌计数法测定溶藻弧菌的粘附作用。粘附的细菌经SYBR GreenⅠ染色后在荧光显微镜下观察，用数码相机拍照后在电脑上计数。试验结果表明，溶藻弧菌对大黄鱼肠粘液的粘附量随菌浓度的升高而升高，并在1—1．5h内趋于饱和；粘附作用在15—30℃、pH偏酸时较强；盐度在5—35范围内对前肠粘液的粘附作用影响不明显，后肠粘液的粘附作用在此范围内随盐度增大而加强，在盐度为0时，溶藻弧菌对前、后肠粘液都无粘附作用；56℃热处理5min及60℃处理1h均能大幅减弱溶藻弧菌对两种肠粘液的粘附作用，表明溶藻弧菌表面的某些热敏结构在粘附作用中起着重要作用。根据以上结果，可以认为溶藻弧菌能够很好地粘附于大黄鱼肠粘液层，其粘附作用受温度、盐度、pH值等环境因子影响很大，溶藻弧菌表面的某些热敏结构可能在粘附过程中起着重要作用。研究结果表明，溶藻弧菌对大黄鱼肠粘液的粘附作用是可控制的，这对于鱼类养殖疾病的控制有一定的参考价值。     

带鱼肠道中芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵液抗菌性质研究

从带鱼肠道中分离筛选到1株具有广谱抗菌活性的菌株JFL15,其发酵液对嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、查氏弧菌均有较强抑菌作用。通过形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系统发育进化分析,菌株JFL15与暹罗芽孢杆菌的同源性最高,达98.05%,初步鉴定为暹罗芽孢杆菌。对暹罗芽孢杆菌JFL15的发酵液进行研究发现,暹罗芽孢杆菌JFL15的发酵液对酶、温度、酸碱度和紫外线均不敏感,且发酵产物储存较长时间后仍具有较强抑菌活性。     

养殖牙鲆致病性弧菌的鉴定及药敏分析

2020年丹东东港市某养殖厂养殖1龄牙鲆(Paralichthys olivaceus)突发病害,表现为腹水病症状。取患病的5尾养殖牙鲆的鳃、肝、脾、肠道、腹水为材料进行细菌分离及纯培养,选择优势菌株通过全自动细菌分析仪及16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定,结果表明分离纯培养的14株菌(DS200401-DS200414)共鉴定出2种,其中1种为该病的致病菌:弧菌属灿烂弧菌(Vibrio splendidus)。随后进行人工感染试验和药敏试验。用12种抗菌药物对3种菌进行药敏试验,结果显示在不同菌株间无明显的敏感与耐药性差异。     

山东近海主要养殖动物的弧菌检测与现害防治的研究

本文从１９９９年秋季采集的山东近海鲈鱼、牙鲆、黑鲷、梭子蟹、牡蛎等５种主要养殖动物中分离出１１０个菌株，经形态、生理、生化测定，由计算机数值分类和《伯杰氏细菌鉴定手册》相结合，鉴定出溶藻胶弧菌、副溶血弧菌等９种菌属弧菌１种嗜水气单胞菌。文中尚对养殖生物弧菌病害的防治作了初步探讨。