养殖大菱鲆腹水症病原菌SR1的分离及鉴定

从患腹水症的养殖大菱鲆（Scophthalmus maximus）腹水分离到1株优势细菌SR1，人工感染实验证实其具有致病性。经API ID32E系统鉴定为溶藻弧菌（Viibrio alginolyticus），并测定了其16S rRNA基因序列和热激蛋白HSP60（Heat shock protein，HSP）基因序列。基于16S rRNA基因序列构建的系统树结果表明，菌株SR1与溶藻弧菌（AY967727）亲缘关系最近，然而置信度较低，仅有27％，不能有效地鉴定到种。HSP60基因序列分析表明，该菌株与溶藻弧菌（AF230931）同源性最高，为99．2％。系统发育树表明SR1确与溶藻弧菌（AF230931）聚为一个分支，且置信度较高，为84％。综合上述结果，菌株SR1可鉴定为溶藻弧菌。[中国水产科学，2006，13（4）：603—609]     

小杂鱼携带细菌与大菱鲆疾病发生的相关性

腹水病是工厂化养殖大菱鲆的一种常见病和多发病，常造成鱼类大规模的死亡。2006年6月山东某大菱鲆Scophthalmus maximus养殖场发生大规模腹水病，通过对病鱼细菌的分离、纯化和培养，对养殖井水、养殖池水和所用饵料小杂鱼进行细菌追踪调查，将从该养殖场所用小杂鱼中分离得到的细菌RF-1与鱼体分离的细菌FS-1进行比较，并对其进行人工感染试验，结果证明这2株菌对健康大菱鲆都具有很强的致病性，而且感染症状完全一致。进而对这2株菌进行了API—ID32E鉴定、传统的生理生化鉴定和16S rRNA序列分析，发现小杂鱼携带细菌RF-1与病原菌FS-1具有一致性，均为溶藻弧菌（Virio alginolyticus）。最后对这2株细菌进行了药敏试验，为控制疾病的发生和蔓延提供用药指导。     

一株文蛤弧菌的筛选及鉴定

从发病的文蛤中筛选到1株菌株MP-1,对其进行了常规的生理生化鉴定及16SrDNA鉴定。从形态、生理生化、系统发育学、16SrDNA基因序列同源性等方面分析,菌株MP-1可以鉴定为弧菌属（Vibrio）溶藻弧菌,暂命名为Vibrio Alginolyticus.MP。     

发病鲆鲽类分离菌株的16S rRNA基因测序分析

细菌性疾病是中国海水养殖鲆鲽类的主要病害,为全面了解病原菌种类,本研究对1999~2012年从山东、江苏、河北、天津等沿海地区养殖场发病鲆鲽鱼类中分离得到的124株优势菌株进行了16S rRNA基因测序和系统发育学分析。将基因序列与GenBank核酸序列数据库进行相似度比对分析,结果显示,有83株与弧菌属(Vibriosp.)细菌相似度最高,11株与气单胞菌属(Aeromonas sp.)细菌相似度最高,4株与爱德华氏菌属(Edwardsiella sp.)细菌相似度最高,26株为其他15种属的细菌。根据系统发育学分析结果,进一步将66株菌鉴定为16个种,优势种为溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、鳗弧菌(V.anguillarum)、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)和迟缓爱德华氏菌(E.tarda)。选择其中的9株鳗弧菌和4株迟缓爱德华氏菌进行人工感染实验,结果显示,其中7株鳗弧菌和3株迟缓爱德华氏菌对大菱鲆(Scophthalmus maximus)有较强的致病性。研究结果可为阐明中国海水养殖鲆鲽类的流行病发生历史、病原种类、病原监测及疾病控制提供重要参考。     

罗氏沼虾致病性溶藻弧菌的鉴定及药敏分析

自广东省湛江市某养殖场患病的罗氏沼虾幼虾匀浆液内分离到一株优势菌QY170324,通过细菌微量生化鉴定管与16SrDNA序列分析对该株优势菌进行鉴定,并进行药敏特性分析和人工感染试验。结果显示,该菌嗜盐性,兼性厌氧,为革兰氏阴性弧菌,能利用蔗糖、甘露糖,赖氨酸脱羧酶、V-P试验均为阳性,在含3%、6%、8%、10%NaCl胨水中均能生长;根据其菌落形态观察、生理生化特性测定,结合《伯杰氏细菌鉴定手册》,鉴定该菌为溶藻弧菌。通过PCR扩增该菌的16SrDNA基因,经过测序及BLAST比对,菌侏OY170324与溶藻弧菌的同源性高达99%;经人工回归感染试验,该菌有较强的致病力。分离的溶藻弧菌QY170324对庆大霉素、四环素、哌拉西林、氧氟沙星、头孢他啶、复方新诺明等抗生素高度敏感,对头孢曲松、卡那霉素、新霉素、米诺环素、麦迪霉素、头孢唑林、多黏菌素B中度敏感,对克林霉素、羧苄西林、头孢氨苄耐药。     

1株鲢病原弧菌的分离鉴定

从养殖的患病鲢(Hypophthalmichthys molitrix)组织分离出1株病原菌CQWL002,革兰氏阴性,短杆状,菌落半透明。经回归感染试验,证明该菌为鲢的病原菌。用API系统结合常规生理生化实验对该菌进行初步鉴定。为了进一步确定该菌的分类学地位,测定了其16SrDNA序列,分析了相关细菌的同源性,构建其系统发育树。结果表明,该菌株与河流弧菌(Vibrio fluvialis)的亲缘关系最近。综合上述几种方法的鉴定结果,最后鉴定株菌CQWL002为河流弧菌。     

养殖大黄鱼低温弧菌病病原的研究

浙江沿海深水网箱养殖大黄鱼冬天发生大量死亡，从病鱼体内分离出致病力较强的细菌GYC0227。人工感染试验证实这株菌为大黄鱼的病原菌。对细菌进行了形态、生理生化特性的测定，并进行了16S rRNA分子鉴定。PCR扩增获得了GYC0227菌株大小约1．5kb的16S rDNA部分基因片段，产物经回收纯化，克隆到pMD18-T载体，转化大肠杆菌TG1，对阳性克隆子进行酶切及PCR鉴定，并测序，将测定的序列递交NCBI进行BLAET同源序列比对，与溶藻弧菌的标准菌株的16S rDNA具有96％的同源性。结合菌株的生理生化特性，GYCD227菌株属于溶藻弧菌。该菌适应于低温生长，生长温度范围为7—25℃，并测定了其对14种药物的敏感性。     

大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)的分离鉴定

从患腹水病大菱鲆Scophthalmus maximus的肝脏中分离到一株优势细菌G1,经人工感染实验表明G1为引发大菱鲆腹水病的致病菌,且半致死浓度为LD50=1.21×105 CFU·g-1。采用常规的生理生化鉴定方法及分子生物学方法对G1进行分析,结果表明,G1的16SrRNA基因序列与杀鱼爱德华氏菌Edwardsiella piscicida的同源性达100%,系统发育分析表明菌株G1与杀鱼爱德华氏菌分支聚为一支,结合生理生化鉴定结果确定G1为杀鱼爱德华氏菌。药敏试验表明菌株G1对头孢曲松、环丙氟哌酸、左氧氟沙星等8种抗菌药物高度敏感。     

5株鲆鲽鱼类病原菌多克隆抗体的制备与应用

本研究制备了鳗弧菌Vibrio anguillarum、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida、副溶血弧菌V. parahaemolyticus、哈维氏弧菌V. harveyi和腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens 5株鲆鲽鱼类病原菌的兔抗血清,建立了5种菌的间接ELISA检测方法,并将该检测方法用于鱼类细菌分离物病原检测。人工感染结果显示,5株菌对大菱鲆的半数致死量(LD50)在102~107CFU/fish;制备的兔抗血清效价分别为1∶2 048 000、1∶16 000、1∶16 000、1∶1 024 000、1∶128 000;交叉反应结果显示,鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌3株弧菌与抗血清相互之间存在交叉反应;抗血清特异检测灵敏度分别为104、108、107、105、106cell/ml;对13株海水鱼类细菌分离物进行检测,有1株腐败希瓦氏菌阳性,两株哈维氏弧菌阳性;1株副溶血弧菌和哈维氏弧菌均为阳性,该结果与16S rDNA序列的分子分析方法一致。     

斜带石斑鱼3种致病性弧菌的分子生物学鉴定

从患病斜带石斑鱼分离到3株病原菌EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801，经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类。为了进一步确定其分类地位，测定了3株病原菌的16SrRNA和HSP60(heat shock protein，HsP60)基因部分序列。16SrRNA基因系统进化分析表明，3株病原菌与哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌亲缘关系较近，相互之间同源性均大于98．6％，差异不明显。HSP60基因序列分析表明，菌株EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801 HSP60基因序列分别与哈维氏弧菌(AF230934)、溶藻弧菌(Ab230931)、副溶血弧菌(AF230951)HSP60基因的同源性最高，依次为95．7％、99．8％和99．8％，而与其它弧菌HSP60基因的同源性均低于90．6％，3株病原菌相互之间的同源性低于91．0％。HSP60基因构建的系统进化树表明，EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801分别与Vibrio harveyi、Vibrio alginolyticus、Vibrio parahaemolyticus聚类。综合上述结果，菌株EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801可分别鉴定为哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌。结果表明，HSP60基因比16SrRNA基因更适合用于海水鱼致病性弧菌种问的分类研究。     

豫北地区主要淡水鱼类感染嗜水气单胞菌的流行病学调查

对豫北地区嗜水气单胞菌引起的细菌性败血病进行流行病学调查,分离鉴定致病性嗜水气单胞菌菌株,并对致病性嗜水气单胞菌菌株进行毒力验证和药敏试验。采集4个养殖场病鱼标本及水样,每月进行流行病学调查,利用生理生化及分子生物学方法检测嗜水气单胞菌的分布状况。结果显示,筛选出52株为嗜水气单胞菌,其中32株为致病性嗜水气单胞菌,20株为非致病性嗜水气单胞菌,且致病性嗜水气单胞菌主要分布在7—9月份,毒力验证试验表明,32株致病性菌株的毒力大小差异明显,筛选出强毒株XDMG(4),为后期试验的疫苗株做准备;药敏试验表明,不同菌株对同一种药物的药敏结果不同,但大部分药物的药敏结果基本一致,70%以上的致病性菌株对头孢哌酮、氟本尼考、菌必治、阿米卡星等抗菌药物表现为高度敏感,对青霉素类药物表现为高度耐药性,耐药率达100%,对氨基糖苷类(不包括阿米卡星)、磺胺类、四环素等药物呈现不同程度的耐药性,具有多重耐药性。本试验旨在丰富本地区的鱼类细菌性败血病的病原资料,并为该菌引起的人类疾病的防控提供科学依据。     

剑尾鱼在检测细菌毒力方面的应用

用１８株从鱼类所分离的细菌攻毒剑尾鱼,结果显示细菌对剑尾鱼的毒力与回归感染或攻毒敏感鱼的毒力结果较为一致,另外,用剑尾鱼感染病原菌的适宜途径为背肌注射,与原代比较,近交高代剑尾鱼个体之间对病原菌的反应较为一致,感染后死亡时间相对集中。水生实验动物剑尾鱼在检测鱼类细菌的毒力方面有较好的应用前景。     

美洲红点鲑溃烂病的病原菌研究

对从患病美洲红点鲑(Salvelinus fontinalis)体表患病部位和肾脏分离到菌株进行了鉴定及药物筛选。结果显示:人工感染试验证实为病原菌,该菌革兰氏染色阴性,菌体呈短杆状。综合该菌形态、生理生化分析结果初步鉴定两株菌均为杀鲑气单胞菌(American salvelinus)杀鲑亚种。用引物AP1和AP2对纯化后的细菌进行PCR扩增,结果扩增出长度为550 bp的DNA片段,对扩增片段进行测序,用NCBI BLAST在GenBank中搜寻相似序列,结果与杀鲑气单胞菌各株A层蛋白部分编码基因有99%以上的序列同源性。进一步证明了鉴定结果。该菌对强力霉素、左氟沙星、氟罗沙星、庆大霉素等13种药物均敏感。     

九孔鲍消化道及养殖水体中弧菌胞外毒力因子的分析

从汕尾健生鲍鱼养殖场成鲍养殖水体和消化道中分离筛选到22株弧菌,其中14株来自成鲍消化道,8株来自养殖水体。本文对这两种不同来源的菌株进行了致病因子(胞外酶及溶血毒素)的分析比较,同时采用API条带法对其进行了种类鉴定。结果发现,消化道中除1株溶藻弧菌和3株最小弧菌外,其余均为河流弧菌;而水体中除副溶血弧菌和创伤弧菌各1株外,其他也均为河流弧菌。实验还发现,在5株胞外酶分泌能力最强的弧菌中,只有Sh031株是副溶血弧菌,另外4株(Bh14、Sh02、Sh08、Sh05)均为的河流弧菌。结果显示,无论是养殖水体还是消化道,河流弧菌都应视为一种海水养殖贝类(鲍)的主要条件致病菌,是能力较强的胞外致病因子生产者。     

日本鳗鲡败血腹水病病原研究

2000年3月中旬，自福建仙游某日本鳗鲡（Anguilla japonica)养殖场患败血腹水症的发病日本鳗鲡的肝脏及腹水处分离到四株细菌，经鉴定其中一株为迟钝爱德华氏菌（dwardsiella tarda)，一株温和气单胞菌（Aeromomas sobria)和两株嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)溶血试验，小鼠攻毒试验显示，上述四株细菌都有较强制 毒力，综合分析，上述菌株可能是引发这次日本幼鳗败血腹水病之病原菌。     

牙鲆病原迟钝爱德华氏菌的药物敏感性测定与分析

对分离并经鉴定的牙鲆病原迟钝爱德华氏菌进行了常用抗菌类药物的敏感性测定,结果表明供试的35株迟钝爱德华氏菌,均对所测定的37种抗菌类药物中的头孢唑啉等20种药物高度敏感、对青霉素G等5种药物耐药、对氨苄青霉素等12种药物表现在株间存在差异。     

Host-specific pathogenicity of strains of Vibrio anguillarum isolated from rainbow trout Salmo gairdneri Richardson and saithe Pollachius virens (L.)

Abstract. Vibrio anguillarum strains isolated from diseased rainbow trout were found to be pathogenic to salmonids and probably to a very low extent to saithe. Strains isolated from saithe were pathogenic to saithe and non-pathogenic to salmonids.     

养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性分析

为了解引起养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性情况,针对2002-2010年由不同地区病样分离的27株细菌性病原进行了16S rDNA鉴定,并采用K-B法测定了27株细菌对22种抗生素的耐药性,分析了病原菌的耐药谱及耐药率变化.结果显示,大菱鲆腹水病病原菌主要有大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas espejiana).山东青岛地区以大菱鲆弧菌为主,威海地区以迟钝爱德华氏菌为主,烟台地区菌株种类分布平均.5类细菌对青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、复方新诺明耐药率高于50％.只有1株迟钝爱德华氏菌对氟苯尼考产生了耐药,其余菌株对其均没有耐药性,且在长期使用中不易产生耐药性,证实氟苯尼考为当前防治腹水病的一种良好抗菌药物.27株病原菌的耐药谱数量为27个,每个菌株具备自己独特的耐药谱,74.1％的菌株对10种以上的抗菌药物产生了耐药性,均有多重耐药性.     

Morphological and physiological characteristics of Saprolegnia spp. strains pathogenic to Atlantic salmon, Salmo salar L

Seventeen strains of Saprolegnia spp. were examined for morphological and physiological characteristics, and seven were examined for their pathogenicity to Atlantic salmon, Salmo salar L. Two of the Saprolegnia strains tested caused 89 and 31% cumulative mortality in challenged salmonids and were significantly more pathogenic than the other strains tested. The positive control (Saprolegnia parasitica ATCC 90213) caused 18% mortality, but this was not significantly higher than non-pathogenic strains (0-3% cumulative mortality). All the pathogenic Saprolegnia strains and two non-pathogenic strains had secondary cysts with long, hooked hairs, a characteristic which is claimed to be typical of S. parasitica. This characteristic is apparently necessary, but does not in itself determine the ability to cause mortality in Atlantic salmon. However, all the pathogenic Saprolegnia strains in the present study showed a significantly higher initial growth rate of cysts in sterilized tap water than did non-pathogenic strains. The results of the present study suggest that initial growth rate of germinating cysts in pure water, together with the presence of long hooked hairs on the secondary cysts, may be indicators of pathogenicity of Saprolegnia strains to Atlantic salmon.