水产动物6种主要病原菌与抗血清的免疫交叉反应

采用ELISA、试管凝集、Western-blot等方法,分析了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V. harveyi)、溶藻胶弧菌(V. alginolyticus)、副溶血弧菌(V. paraheamolyticus)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和荧光假单胞菌(Psedomonas fluorescens)等水产养殖中主要病原细菌与抗血清之间的免疫交叉反应.结果表明,弧菌属细菌之间的交叉反应程度比较大,而与其他两属的细菌之间存在的交叉反应程度小,或不存在交叉反应;Western-blot分析结果显示,哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌和副溶血弧菌抗血清分别与其他3种弧菌在分子量为135.6 kD和121.5 kD;95.6 kD,48.4 kD,39.2 kD和34.9 kD;55.1 kD的蛋白带处存在交叉反应,而这些分子量的蛋白带与其他两属的抗血清均不发生反应.     

鱼肠道弧菌胶体金快速检测试纸研制

鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)可引起多种养殖鱼类发病死亡, 给鱼类养殖业带来严重经济损失。为解决养殖过程中鱼肠道弧菌的现场快速检测问题, 本研究研制了鱼肠道弧菌胶体金快速检测试纸。通过制备兔抗鱼肠道弧菌多克隆抗体, 间接ELISA分析发现其与鱼肠道弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外产物及全菌破碎蛋白发生阳性免疫反应, 与副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的4种抗原蛋白发生程度不等的免疫交叉反应。制备胶体金标记鱼肠道弧菌抗体, 确定了鱼肠道弧菌4种抗原蛋白的划线浓度, 以4种抗原蛋白作为4条检测线, 羊抗兔IgG作为质控线, 基于竞争法免疫层析技术研制出鱼肠道弧菌快速检测试纸。对鱼肠道弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌和哈维氏弧菌的检测结果显示, 该试纸可以准确鉴别出鱼肠道弧菌, 并能判别其他病原菌的交叉反应。该试纸对鱼肠道弧菌的最低检测限为5×10⁵ CFU/mL, 检测耗时为10 min。对患病牙鲆组织的检测结果显示, 该试纸与ELISA结果一致, 表明具有较好的检测准确性。本研究为水产养殖现场的鱼肠道弧菌快速、准确检测提供了有力工具。     

对虾养殖池中一株弧菌拮抗菌的分离鉴定

从对虾养殖池中分离出1株编号为2013082515(简称菌株15)的菌株,以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)为指示菌,分析了菌株15对指示菌的抑菌效果及最低抑菌浓度,同时,分析了菌株15对其他7株弧菌的抑菌效果.结果显示,菌株15对3株指示菌均具有抑菌效果,对鳗弧菌、哈维氏弧菌及副溶血弧菌的最低抑菌浓度分别为2.50×104、2.50×105、2.50×105 CFU/ml;对其他弧菌也具有一定的抑菌效果.采用注射及浸泡感染方法分析了菌株15对对虾的生物安全性,结果显示,在高浓度时,菌株15对对虾具有潜在毒性.分别用细菌全细胞脂肪酸气相色谱法和16S rDNA序列分析比对法对该菌进行分类鉴定,表明菌株15为一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.).     

致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测

从山东沿海的发病鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到1株致病性哈维氏弧菌（Vibrio harveyi），从该菌的染色体DNA扩增出一条长约1．4kb的特异性片段。DNA序列分析表明，该克隆片段含有完整的1254bp溶血素基因，该溶血素基因与哈维氏弧菌VIB645的溶血素基因VhhA和VhhB的相似性分别为99．0％和98．5％；与副溶血弧菌（V．parahaemolyticus）热稳定性溶血素基因（TDH）的相似性为74．5％；与拟态弧菌（V．mimicus）、创伤弧菌（V．vulnificus）、霍乱弧菌（V．chderae）磷脂酶基因的序列相似性分别为57．4％、59．2％、53．0％；与最小弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、霍氏弧菌（V．hollisae）、河流弧菌（V．tguvialis）、鳗弧菌（V．anguillarum）的溶血素基因的相似性仅为19．9％～24．8％。根据溶血素基因的保守区段，设计了1对特异引物。分析表明，该引物能特异检测哈维氏弧菌。其可检测的DNA最小量为0．001ng。用该方法对55株不同来源的患病鱼分离的疑似病原菌进行检测，结果检出8株哈维氏弧菌，检出率为14．55％，从健康动物中检出数占所检弧菌数的6．25％，海洋环境为10．53％，海水养殖环境为26．53％，表明哈维氏弧菌在不同的海水环境及健康海洋动物中普遍存在，在养殖水体中的数量高于其他海水环境。     

应用Dot-ELISA快速检测牙鲆腹水病病原的研究

选用硝酸纤维素膜作固相载体,建立检测迟钝爱德华氏菌的斑点酶联免疫吸附试验诊断方法。根据棋盘试验,确定迟钝爱德华氏菌免疫血清最佳工作浓度为1∶800,酶标抗体最佳工作浓度为1∶200,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检测时,迟钝爱德华氏菌呈阳性,温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、腐败希瓦氏菌、产碱普罗威斯登菌、阪崎肠杆菌和大肠杆菌均呈阴性。试验结果表明,Dot-ELISA方法简便、特异、快速、结果直观,便于在基层推广使用。     

豚鼠气单胞菌快速检测间接ELISA法的建立

应用从患败血症的鳗鲡中分离、纯化出的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)菌株AB40511NA1,制备了兔抗血清,建立了快速检测豚鼠气单胞菌的间接ELISA方法.研究结果显示:AB40511NA1兔抗血清的效价为1:16000.该法对AB40511NA1最低检测量为6×104 cfu·mL-1;与水产养殖动物主要致病菌嗜水气单胞菌(A. hydrophila)、温和气单胞菌(A. sobria)、鳗弧菌(V. anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)及非O1-群霍乱弧菌(Non-O1 Vibrio cholerae)均无交叉反应,特异性强;能快速、准确、方便地检测出豚鼠气单胞菌.     

不同海洋弧菌中5类溶血素基因的分布及其与溶血活性和磷脂酶活性的相关性

用57株海洋弧菌,包括26株弧菌标准菌株、20株哈维氏弧菌、11株副溶血弧菌(从不同宿主和不同地理环境中分离得到),用PCR法合成5类相应的地高辛标记的溶血素基因探针,利用其进行Southern Blot,检测这5类溶血素基因在57株弧菌中的分布。结果显示,在57海洋株弧菌中,含有TDH、HlyA、TLH、δ-VPH和HLX溶血素基因的菌株分别为2株、2株、49株、3株和30株。另外,1株霍氏格里蒙菌(Grimontia hollisae)和1株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)中分别含有2个TDH溶血素基因。用鱼血平板和卵磷脂平板检测57株弧菌的溶血活性和磷脂酶活性,结果表明,弧菌溶血活性和磷脂酶活性与TLH溶血素基因具有显著相关性,与另外4类溶血素基因的关系不明显。     

柱状黄杆菌间接ELISA快速检测方法的研究

应用间接酶联免疫吸附试验(Indirect-ELISA)技术,建立了快速检测柱状黄杆菌的方法。结果显示:根据棋盘试验,确定最佳抗原包被浓度和免疫血清最佳工作浓度分别为1×106cfu/mL和1∶5000,酶标抗体最佳工作浓度为1∶10000。在该条件下,所建立的间接ELISA能检测出5×104cfu/mL的柱状黄杆菌,且与爱德华氏菌、哈维氏菌弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等常见鱼类致病菌无交叉反应。结果表明,所建立的间接ELISA可不经细菌培养而直接检测人工感染后草鱼鳃组织中的柱状黄杆菌,该方法对柱状黄杆菌的检测具有快速、敏感、特异、实用的优点。     

发病鲆鲽类分离菌株的16S rRNA基因测序分析

细菌性疾病是中国海水养殖鲆鲽类的主要病害,为全面了解病原菌种类,本研究对1999~2012年从山东、江苏、河北、天津等沿海地区养殖场发病鲆鲽鱼类中分离得到的124株优势菌株进行了16S rRNA基因测序和系统发育学分析。将基因序列与GenBank核酸序列数据库进行相似度比对分析,结果显示,有83株与弧菌属(Vibriosp.)细菌相似度最高,11株与气单胞菌属(Aeromonas sp.)细菌相似度最高,4株与爱德华氏菌属(Edwardsiella sp.)细菌相似度最高,26株为其他15种属的细菌。根据系统发育学分析结果,进一步将66株菌鉴定为16个种,优势种为溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、鳗弧菌(V.anguillarum)、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)和迟缓爱德华氏菌(E.tarda)。选择其中的9株鳗弧菌和4株迟缓爱德华氏菌进行人工感染实验,结果显示,其中7株鳗弧菌和3株迟缓爱德华氏菌对大菱鲆(Scophthalmus maximus)有较强的致病性。研究结果可为阐明中国海水养殖鲆鲽类的流行病发生历史、病原种类、病原监测及疾病控制提供重要参考。     

Biolog GN法对不同地区养殖对虾弧菌区系的比较研究

采用Biolog细菌鉴定技术,分析来自5个国家的4个对虾养殖品种苗期及部分养成期虾体上的185株弧菌(其中24株来自成虾).结果表明:来源、种类不同的养殖对虾苗期的主要弧菌的区系组成相似,溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鲨鱼弧菌(V. carchariae)(即哈维氏弧菌V. harveyi)是普遍存在的种类,同一种对虾在不同地区养殖,其区系组成略有差异;哈维氏弧菌多为对虾苗期致病菌,副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)主要为成虾致病菌;在健康虾苗和发病虾苗体内都可分离到溶藻弧菌.