杂色鲍肌肉萎缩症病原菌的分离鉴定及系统发育分析

近几年中国南方杂色鲍（Haliotis diversicolorReeve）养殖场频繁爆发严重的肌肉萎缩症,该病能感染各种规格杂色鲍,死亡率很高。病鲍症状主要表现为外套膜和内脏团萎缩、无生气,附着力下降,最终死亡。该试验从病鲍组织分离到1株优势菌WS,人工感染试验证实其对健康杂色鲍有很强致病性,且与自然发病的杂色鲍症状相同。对菌株WS进行形态学观察和生理生化检测,结果显示与哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）最为接近。为了进一步确定其分类地位,采用1对通用引物扩增其16S rDNA序列片断进行序列分析和同源性对比,构建系统发育树,结果表明,菌株WS与弧菌属的V.harveyi[AY750577]聚为1个分支,且同源性达99.70%。综合上述3种鉴定结果,确定该菌为哈维氏弧菌。     

鲍弧菌病的防治研究

在实验室进行鲍人工感染弧菌病的防治试验。结果说明:使用鲍防病配合饲料对于防治养殖鲍弧菌病效果显著。并从东山养鲍场患病的九孔鲍体上分离到一种致病菌,经鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。     

杂色鲍养殖环境中致病性弧菌分布调查

从深圳不同的杂色鲍人工养殖场采集并分类环境生物样品。应用TCBS平板分离并作生理生化初步鉴定弧菌,平板涂布法统计水样和各类生物每mL(或每g)所含弧菌总数,并应用基于16S~23SrDNA间区序列设计的4种水产病原弧菌特异性引物进行PCR,定性检测各类环境样品所携带致病性弧菌的分布状况。结果显示,弧菌广泛存在于杂色鲍养殖环境中,且杂色鲍养殖池池水中的弧菌密度大于进水口海水。在养殖环境生物中,不同环境生物中每克生物所携带的弧菌数差别很大,其中盘管虫、海蟑螂、等足类所携带的弧菌数最多,而海鞘携带的弧菌数最少。在常见的4种致病性弧菌的检测结果上,创伤弧菌和溶藻弧菌阳性率均为3.4%。通过研究弧菌在杂色鲍养殖环境中弧菌的分布特征,为杂色鲍养殖中流行性弧菌病的预防提供科学依据。     

斜带石斑鱼3种致病性弧菌的分子生物学鉴定

从患病斜带石斑鱼分离到3株病原菌EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801，经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类。为了进一步确定其分类地位，测定了3株病原菌的16SrRNA和HSP60(heat shock protein，HsP60)基因部分序列。16SrRNA基因系统进化分析表明，3株病原菌与哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌亲缘关系较近，相互之间同源性均大于98．6％，差异不明显。HSP60基因序列分析表明，菌株EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801 HSP60基因序列分别与哈维氏弧菌(AF230934)、溶藻弧菌(Ab230931)、副溶血弧菌(AF230951)HSP60基因的同源性最高，依次为95．7％、99．8％和99．8％，而与其它弧菌HSP60基因的同源性均低于90．6％，3株病原菌相互之间的同源性低于91．0％。HSP60基因构建的系统进化树表明，EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801分别与Vibrio harveyi、Vibrio alginolyticus、Vibrio parahaemolyticus聚类。综合上述结果，菌株EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801可分别鉴定为哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌。结果表明，HSP60基因比16SrRNA基因更适合用于海水鱼致病性弧菌种问的分类研究。     

养殖大黄鱼低温弧菌病病原的研究

浙江沿海深水网箱养殖大黄鱼冬天发生大量死亡，从病鱼体内分离出致病力较强的细菌GYC0227。人工感染试验证实这株菌为大黄鱼的病原菌。对细菌进行了形态、生理生化特性的测定，并进行了16S rRNA分子鉴定。PCR扩增获得了GYC0227菌株大小约1．5kb的16S rDNA部分基因片段，产物经回收纯化，克隆到pMD18-T载体，转化大肠杆菌TG1，对阳性克隆子进行酶切及PCR鉴定，并测序，将测定的序列递交NCBI进行BLAET同源序列比对，与溶藻弧菌的标准菌株的16S rDNA具有96％的同源性。结合菌株的生理生化特性，GYCD227菌株属于溶藻弧菌。该菌适应于低温生长，生长温度范围为7—25℃，并测定了其对14种药物的敏感性。     

养殖大菱鲆腹水症病原菌SR1的分离及鉴定

从患腹水症的养殖大菱鲆（Scophthalmus maximus）腹水分离到1株优势细菌SR1，人工感染实验证实其具有致病性。经API ID32E系统鉴定为溶藻弧菌（Viibrio alginolyticus），并测定了其16S rRNA基因序列和热激蛋白HSP60（Heat shock protein，HSP）基因序列。基于16S rRNA基因序列构建的系统树结果表明，菌株SR1与溶藻弧菌（AY967727）亲缘关系最近，然而置信度较低，仅有27％，不能有效地鉴定到种。HSP60基因序列分析表明，该菌株与溶藻弧菌（AF230931）同源性最高，为99．2％。系统发育树表明SR1确与溶藻弧菌（AF230931）聚为一个分支，且置信度较高，为84％。综合上述结果，菌株SR1可鉴定为溶藻弧菌。[中国水产科学，2006，13（4）：603—609]     

一株文蛤弧菌的筛选及鉴定

从发病的文蛤中筛选到1株菌株MP-1,对其进行了常规的生理生化鉴定及16SrDNA鉴定。从形态、生理生化、系统发育学、16SrDNA基因序列同源性等方面分析,菌株MP-1可以鉴定为弧菌属（Vibrio）溶藻弧菌,暂命名为Vibrio Alginolyticus.MP。     

引发杂色鲍苗掉板死亡的溶藻弧菌分离鉴定及毒力分析

跟踪观察了广东汕尾鲍鱼养殖场的培苗过程,并从变白病鲍苗中分离到1株优势菌(1号菌株).2次不同时间、不同地点的回归感染实验均证明其可引发鲍苗死亡掉板,API条带分析表明其为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus);胞外毒力因子分析揭示该菌株可分泌蛋白酶、脂肪酶、明胶酶以及拥有明显的溶血能力.结果证明了溶藻弧菌可引发我国南方杂色鲍苗掉板死亡.     

夏季保苗期刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征病原菌的分离鉴定及其致病阈值

2013年夏季山东地区某刺参育苗场处于保苗期的刺参苗种暴发 腐皮综合征疾病,表现为附着力下降、棘刺顶端溃烂、排脏、表皮溃疡和自溶等症状。自患病个体病灶组织分离优势细菌,并利用形态学观察、生理生化测定、回接感染、16S rDNA基因序列分析等方法完成致病原的鉴定。此外,通过对发病前后养殖系统中优势菌丰度的变化,追踪确定了所分离病原菌的致病阈值。结果显示,从患病参苗体表病灶处分离的一株优势菌HP130917A-1,经回接感染证实,该菌株具有较强的致病力,其对刺参苗种的半致死浓度为1.2×106 CFU/ml。生理生化结合分子鉴定表明,该菌株为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。此外,完成了患病池保苗期间池水和附着基表面微生物菌群结构动态分析,共分离得到了6种主要优势菌,分别为溶藻弧菌、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)。溶藻弧菌一直是养殖系统中优势度最高的种类,且随着附着基在保苗池中时间的延长,其在附着基表面沉积物中的浓度越来越高。到第50天时,浓度达到8.97×106 CFU/cm2。而此时系统中参苗开始暴发腐皮综合征疾病,可将此浓度视为该病原的致病阈值。因此,在夏季保苗过程中应加强养殖系统中弧菌总数的监测,制定适宜的附着基更换频率,建立和优化刺参保苗工艺,以期为刺参苗期疾病防控和优化健康养殖管理提供理论依据和参考。     

中间轴孔珊瑚白化病病原菌的分离与鉴定

人工繁育的中间轴孔珊瑚(Acropora intermedia)出现白化病症状,且白化范围呈蔓延趋势,严重的甚至出现死亡。为探明此次养殖中间轴孔珊瑚白化病的病因,对患病珊瑚进行了病原学研究。从患病珊瑚基部病灶部位分离得到一株优势菌株JU-V039,该菌株经Biolog生理生化分析和16S rRNA基因发育进化树分析,鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。再经人工回接感染,证实溶藻弧菌是引起此次珊瑚白化病的致病原。药物敏感实验显示,该菌株对13种检测抗菌药物的耐药率为15.4%,其中对利福平、复方新诺明、链霉素、红霉素、左氧氟沙星、头孢噻肟、卡那霉素、四环素、萘啶酸和氯霉素10种实验药物表现敏感(S);对青霉素G和氨苄西林表现耐药(R);对多粘菌素B则表现中介(I)。溶藻弧菌与此次养殖中间轴孔珊瑚白化病的发生有直接关系,研究结果有助于进一步了解珊瑚白化病的致病机理,并给出科学有效的疾病控制方案。     

一株凡纳滨对虾病原菌的分离、鉴定及其致病力分析

从患病凡纳滨对虾肝胰腺中分离出菌株20100612001,经人工感染实验证实,该分离菌株对凡纳滨对虾的半数致死量为1.44×106CFU/ml。形态学观察和革兰氏染色表明,该菌株为革兰氏阴性,无芽孢,有一根端极鞭毛;呈球杆状、球状、棒状或梨状且有两极浓染现象;在2216E培养基上为透明或半透明的圆形菌落,而在TCBS选择性培养基上为绿色或蓝绿色菌落。经Biolog碳源利用反应、脂肪酸气相色谱分析得出,该菌株与副溶血弧菌、需钠弧菌等的生理生化特性最相似;16SrD-NA序列测定表明,该菌株与弧菌属中几株病原菌的同源性均达到98.9%以上。在分子进化树中该菌株与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的进化地位最接近。综合上述实验结果分析得出,该细菌分离物为副溶血弧菌。     

发病鲆鲽类分离菌株的16S rRNA基因测序分析

细菌性疾病是中国海水养殖鲆鲽类的主要病害,为全面了解病原菌种类,本研究对1999~2012年从山东、江苏、河北、天津等沿海地区养殖场发病鲆鲽鱼类中分离得到的124株优势菌株进行了16S rRNA基因测序和系统发育学分析。将基因序列与GenBank核酸序列数据库进行相似度比对分析,结果显示,有83株与弧菌属(Vibriosp.)细菌相似度最高,11株与气单胞菌属(Aeromonas sp.)细菌相似度最高,4株与爱德华氏菌属(Edwardsiella sp.)细菌相似度最高,26株为其他15种属的细菌。根据系统发育学分析结果,进一步将66株菌鉴定为16个种,优势种为溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、鳗弧菌(V.anguillarum)、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)和迟缓爱德华氏菌(E.tarda)。选择其中的9株鳗弧菌和4株迟缓爱德华氏菌进行人工感染实验,结果显示,其中7株鳗弧菌和3株迟缓爱德华氏菌对大菱鲆(Scophthalmus maximus)有较强的致病性。研究结果可为阐明中国海水养殖鲆鲽类的流行病发生历史、病原种类、病原监测及疾病控制提供重要参考。     

梭子蟹牙膏病病原菌——溶藻弧菌的鉴定及其系统发育分析

从山东潍坊池塘养殖的患有牙膏病的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)中分离到1株病原菌(PX25),经回接感染证实为该病的病原菌。经生理生化试验及形态结构观察显示,该菌株革兰氏阴性,短杆状,直或稍弯曲,两端钝圆;固体培养基上培养后进行染色具有周生侧毛,液体培养基中培养后进行鞭毛染色具一极生单鞭毛;悬滴法观察PX25菌株具有很强的运动性。对其16SrRNA基因进行PCR扩增、测序和系统发育分析。结果表明,该菌株与溶藻弧菌亲缘关系最近,相似性达99.35%。综合菌体在形态、生理生化、API20NE与API20E自动鉴定结果、16S rRNA同源性等方面的特性,确认PX25为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。     

青岛陆源排污口邻近海域异养细菌的组成与分布

对青岛近海度假区、港口区、养殖区、工业区4类排污口邻近海域异养细菌的组成与分布进行了调查研究,采用海洋异养细菌平板涂布培养法分离细菌,基于16S rDNA的扩增性DNA限制性酶切片段分析(ARDRA)进行聚类筛选并测序鉴定。结果显示,青岛排污口邻近海域可异养培养的菌株分布于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)4个细菌类群,变形菌门细菌数量占总测序数量的68%,其中γ-变形菌纲的数量在变形菌门中占88%;不同海域中细菌组成与分布有所不同,放线菌门和拟杆菌门的细菌种类较少且各海域分布有所不同,但γ-变形菌纲的弧菌属细菌(Vibrio sp.)在4类海域中均被发现,占总检测量的18.54%,其中溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)占弧菌总量的25%。不同海域也检测到V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.campbellii、V.parahaemolyticus等水产养殖业的潜在致病菌。根据16S rDNA系统进化关系和细菌门类聚类分析得到的结论推断,工业区与养殖区海域的细菌组成和分布相似度较高,推断各海域的细菌组成与排污口类型有一定相关性。     

养殖环境及贝源溶藻弧菌MLST分型及其毒力基因、耐药性分析

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是近年来贝类病害中最常见的细菌性病原之一，对贝类养殖产业的健康发展构成严重威胁。本研究旨在分析不同养殖环境水体和贝类组织中，溶藻弧菌的基因变异、毒力基因、耐药性及其分布规律。对12株溶藻弧菌分离株开展多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)、毒力因子以及菌株耐药性分析，结果显示，12株溶藻弧菌的序列型(sequence typing, ST)分型互不相同，7株为PubMLST数据库已经收录的ST型，5株因管家基因的等位基因位点变化而形成新的ST型，贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有较高的遗传多样性。12株溶藻弧菌都携带tlh、fur和collagenase三种毒力基因，但均未检测到tdh、trh、toxR和tcpA毒力基因。溶藻弧菌携带毒力因子的种类和数量受地区分布等因素的影响。不同来源的溶藻弧菌均具有多重耐药特征，对青霉素和氨苄西林产生抗性。本研究表明，贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有种群复杂、遗传多样性高的特点；不同来源菌株在毒力基因携带和耐药性方面存在较大差异。本研究通过探究不同区域内不同来源的溶藻弧菌遗传变异及耐药性差异，对贝源溶藻弧菌的有效防控提供一定理论参考。     

斑节对虾“红体病”细菌性病原的初步研究

从患“红体病”的斑节对虾中分离到８个菌株,通过致病力试验证实其中两个菌株是引起斑节对虾“红体病”的主要病原,使对虾死亡率分别达到７０％和９０％。根据生化试验,确定这两个菌株分别是嗜水气单胞菌和副溶血弧菌。抗药性实验的结果表明,嗜水气单胞菌菌株对强力霉素较为敏感,副溶血弧菌菌株对氟哌酸、红霉素、青霉素和强力霉素较为敏感。     

凡纳滨对虾虾苗细菌性玻化症(BVS)的病原、病理分析

为进一步查明对虾"玻璃苗"的主要致病原,实验通过对河北省沧州市凡纳滨对虾苗种玻化症进行了流行病学调查及病原、病理分析。结果发现,患病虾苗表现为活力降低、厌食直至空肠、空胃,虾体消瘦、暗浊;肝胰腺组织坏死性萎缩、轮廓模糊、颜色变浅呈淡黄色,甚至肝胰腺区由正常的饱满褐色组织变为无组织结构的"玻璃化"状态。组织病理观察结果显示,患病对虾肝小管上皮细胞坏死、脱落,肝小管中充斥大量的碎片组织,并逐步褐化、黑化,甚至肝小管组织大面积坏死,留有连片玻璃样均质化区域;肠道内充斥大量的组织碎片,绒毛膜脱落消失。超微组织病理观察发现,患病对虾肝小管上皮细胞的细胞膜消融,细胞器解体,细胞核固化;其后细胞解体、脱落,甚至肝小管组织结构解体消融;肝胰腺、肠道、胃黏膜周围发现大量细菌,优势菌株为杆状菌且呈弧形,未发现病毒粒子的存在。从患病虾苗分离出2株优势菌(Lv-A和Lv-B),经人工浸染实验发现,Lv-A和Lv-B可致凡纳滨对虾PL7苗种出现与自然患病相同的玻璃化症状,其半致死浓度分别为1.62×10~3和5.38×10~3 CFU/mL,致病力强。根据16S rDNA和gyrB序列分析结果发现,Lv-A和Lv-B与溶藻弧菌、新喀里多尼亚弧菌和副溶血弧菌均有较高相似性。初步将该病命名为虾苗细菌性玻化症(shrimp postlarva bacterial vitrified syndrome,BVS)。药敏实验结果显示,Lv-A和Lv-B均对米诺环素、多西环素、萘啶酸等敏感,而对新霉素、吡哌酸、利福平等耐药。本研究为BVS的有效防控、保障对虾行业健康发展提供理论基础和技术支撑。