拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）基因的克隆与表达分析

采用qRT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因cDNA全长序列。该基因全长1 558 bp,开放阅读框长度为1 224 bp,编码407个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与昆虫的相似性高达70%,推测MAPKK基因在节肢动物具有较高的保守性。经荧光定量PCR检测,MAPKK基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑神经节和卵巢中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,MAPKK基因在卵巢发育期(Ⅲ期)表达量最高,发育期为卵母细胞快速生长期,推测MAPKK具有促进卵母细胞快速生长的作用。     

中华蛸vasa基因的克隆及表达分析

vasa基因编码的蛋白是DEAD-box (Asp-Glu-Ala-Asp)蛋白家族成员,对真核生物生殖细胞的形成具有关键作用。本研究使用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了中华蛸(Octopus sinensis) vasa基因全长,共2438 bp,其中,开放阅读框长2067 bp,编码688个氨基酸,5′-UTR长128 bp,3′-UTR长244 bp (包含A尾巴)。基于ExPASy、Signal 4.1、TMHMM、SMART等在线软件对Os-vasa基因的蛋白质结构进行预测,得出其氨基酸分子量为76 580.53 Da,理论等电点为5.89。无信号肽,跨膜区域没有明显的信号,因此,推测其为胞内蛋白,不属于膜蛋白。该蛋白具有DEXDc和HELICc 2个功能结构域,而且有9个DEAD-box家族蛋白的典型保守区域,表明所得cDNA属于vasa基因家族。使用qRT-PCR对中华蛸各时期胚胎、初孵幼体及2个发育时期的卵巢及雌雄不同组织的表达模式进行分析。结果显示,Os-vasa基因在性腺中特异性表达,且在卵巢中的表达大于精巢,未成熟和成熟卵巢中均有vasa mRNA表达,且未成熟期表达量较高。因此,推测Os-vasa基因可能在卵巢发育过程和功能维持等方面起到重要作用。在中华蛸早期胚胎发育阶段,均能检测到Os-vasa基因转录本,前10 d微弱表达,从第13天开始,表达量逐渐上升,至第19天达到最高。在初孵幼体阶段,Os-vasa分别在第8天和第20天出现最低和最高表达量。本研究结果可为中华蛸原始生殖细胞起源、迁移和分化提供理论资料,有助于加深对中华蛸卵巢发育和卵子发生过程的理解。     

拟穴青蟹卵泡抑素相关蛋白基因的克隆和表达分析

卵泡抑素相关蛋白(follistatin related protein,FRP)是一种细胞外基质糖蛋白,该蛋白参与细胞增殖、迁移、组织重塑、胚胎发育、细胞间相互作用等多种生理过程。迄今甲壳动物FRP的研究尚未见诸报道。实验采用RACE技术首次克隆了拟穴青蟹FRP基因部分cDNA序列。该序列长度1 948 bp,FRP肽段含有484个氨基酸残基,包括KAZAL-FS结构域、EFh结构域和两个Ig结构域。系统进化树显示拟穴青蟹FRP基因的分子进化地位与其生物学分类地位一致。半定量PCR及荧光定量PCR结果表明,FRP基因在拟穴青蟹的胸神经团、脑和卵巢中表达。FRP基因在卵巢发育各期的表达量各不相同,卵巢未发育期最高,据此我们推测FRP具有抑制卵巢发育的作用。     

拟穴青蟹3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与表达

3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatede hydrogenase,GAPDH)是维持生命最基本活动的关键酶之一.采用RT-PCR、RACE等技术,获得了拟穴青蟹gapdh基因全长cDNA序列.该序列全长1 440 bp,开放阅读框(ORF)为1 008 bp,编码335个氨基酸残基.同源分析显示,该基因编码的蛋白与其他一些物种具有很高相似性,推测gapdh基因具有很高的保守性.经荧光定量PCR检测,gapdh基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达,且在胸神经团、眼柄神经节、卵巢、表皮中表达量较高.在拟穴青蟹卵巢发育过程中,gapdh基因在卵巢发育早期(Ⅱ期)表达量最高,在卵巢发育成熟期(Ⅴ期)表达量最低,由此推测GAPDH主要参与了卵巢的细胞分裂增殖过程.     

拟穴青蟹GRP78基因的克隆与应激表达

葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 ku,GRP78)是热休克蛋白70家族成员之一,在调节蛋白质折叠和维持内质网稳态过程中起着分子伴 侣作用。采用RT-PCR、RACE等技术,首次从拟穴青蟹获得了GRP78的cDNA全长序列。该序列全长2 284 bp,开放阅读框(ORF)为1 962 bp,编码653个氨基酸残基。 同源分析显示,该基因编码的蛋白含有HSP70家族的签名序列,C末端为内质网蛋白滞留信号KDEL,与其他物种具有很高相似性。实时荧光定量PCR结果表明,GRP78 基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达。第一期仔蟹在不同的温度和盐度下暴露12 h后,GRP78基因表达量随环境温度升高而增加;在高盐(30)条件下GRP78表达量 较高,进而推测拟穴青蟹GRP78参与蛋白质折叠和环境胁迫的应答。     

拟穴青蟹Na+/H+ exchanger基因克隆及其在盐度胁迫下的表达分析

克隆了拟穴青蟹(Scylla paramamosain)Na~+/H~+-exchanger基因,其cDNA序列全长3 624 bp,开放阅读框(ORF)长2 886 bp,可编码961个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点分别为110.8 kDa和7.42,具有信号肽和典型的Na~+/H~+-exchanger蛋白结构域,含12个跨膜α螺旋。拟穴青蟹Na~+/H~+-exchanger的氨基酸序列与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的一致度最高,达到84.9%;该基因在卵巢中表达量最高,其次是精巢、鳃等;该基因在受精卵时期表达水平最高,大眼幼体时期次之。拟穴青蟹大眼幼体在低盐(盐度7和17)胁迫过程中,Na~+/H~+-exchanger基因在20 min表达水平最高,之后基本恢复到正常表达水平;在高盐(盐度37)胁迫(20 min～2 h)期间,该基因表达水平先下降再逐渐上升。Na~+/H~+-exchanger基因在拟穴青蟹大眼幼体阶段盐度适应中发挥着重要作用,且低盐显著诱导Na~+/H~+-exchanger基因的高表达,推测拟穴青蟹Na~+/H~+-exchanger基因在低盐环境下发挥重要的渗透调节功能。     

刺参vasa-1ike基因克隆及其在组织中的表达分析

vasa基因编码DEAD-box家族成员中一种ATP依赖的RNA解旋酶，在生殖系分化过程中发挥着重要的作用。本研究采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术（RACE），从刺参（Apostichopus japonicus）精巢中克隆得到vasa的全长cDNA序列。该cDNA序列全长2167bp，开放阅读框1593bp，编码530个氨基酸，具有DEAD-box家族蛋白的全部9个保守域。经同源比对和系统进化分析，确定其属于DEAD-box家族的VASA亚家族成员。利用半定量RT-PCR检测，vasa mRNA专一性的在刺参性腺中表达，据此，刺参vasa基因有望用于其生殖系起源和分化的研究。[中国水产科学，2008，15（3）：407-413]     

拟穴青蟹泛素基因的克隆及其在性腺发育过程中的表达

在实验室所构建的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)EST文库基础上筛选出泛素基因(Ubquitin,Sp-Ub)片段,利用RACE技术克隆其全长cDNA序列,并对其结构进行分析;利用实时定量PCR技术检测该基因在雌蟹各组织及性腺不同发育阶段中的表达情况。结果显示,Sp-Ub基因全长555 bp,编码154个氨基酸,其第1~76个氨基酸为高度保守的泛素结构域,第101~147的氨基酸残基为典型的核糖体蛋白S27a的保守区域;预测的泛素结构域二级结构由5个延伸链,1个α-螺旋及其连接的无规卷曲构成,Sp Ub三维结构由1个α-螺旋以及5个β片层。多重比对表明不同物种的泛素结构域和核糖体蛋白S27a结构域在进化过程中高度保守。定量PCR结果显示,Sp-Ub在鳃中的表达水平最高,卵巢次之,各组织间的表达无显著性差异,说明Sp-Ub基因在各组织中的表达恒定,且具有普遍作用;在卵巢发育过程中,Sp-Ub在O5期的表达水平最高,O1、O4期次之,O2期表达量最低且与O5期具有显著差异(P<0.05);在精巢发育过程中,Sp-Ub在T2期的表达量最高,其次为T1期,T3期表达最低且与T2期具有显著差异(P<0.05)。本研究结果说明了Sp-Ub对拟穴青蟹生殖细胞的生长和发育可能具有重要作用。本研究将为甲壳动物性腺发育调控的分子机制奠定基础。     

黑脊倒刺鲃vasa同源基因的克隆及表达分析

为了从分子水平上研究鱼类生殖细胞发育的机制,首次从重要的经济养殖鱼类——黑脊倒刺鲃中克隆了斑马鱼vasa的同源基因ScVHG。该cDNA长1962bp,编码654个氨基酸,氨基酸序列中含有DEAD蛋白家族特有的9个保守结构域。经比对发现,其编码的蛋白序列与斑马鱼VASA蛋白等具有高度的同源性,与斑马鱼、罗非鱼、虹鳟、银鲫、黄鳝、金鱼、金枪鱼、草鱼的VASA蛋白相似度分别为77%,77%,79%,90%,74%,89%,79%和86%。RT-PCR结果显示:在成鱼不同的组织中,ScVHG仅在精巢和卵巢中表达。RNA原位杂交结果进一步表明:在精子发生中,ScVHG只在精原细胞中表达,而在后期的精母细胞、精子细胞中均未发现明显的表达;在卵子发生中,ScVHG在卵原细胞和卵母细胞的各个时相中均有表达,在卵原细胞中表达最为强烈,而在随后各时相的卵母细胞中,阳性信号逐渐减弱。研究认为,该基因中含有的保守序列、序列的相似性以及该基因在生殖细胞中的特异性表达等结果均表明,克隆得到的ScVHG是斑马鱼vasa的同源基因,此基因可作为一种有效的分子标记,用于黑脊倒刺鲃以及其他鱼类生殖细胞发育机制的研究。     

拟穴青蟹14-3-3基因全长cDNA的克隆及组织表达分析

采用RT-PCR及RACE技术,从拟穴青蟹眼柄组织中克隆获得14-3-3基因cDNA全序列.序列分析结果表明:拟穴青蟹14-3-3基因全长1112bp,开放阅读框长744 bp,编码由247个氨基酸组成的蛋白,分子量为28.086 ku,等电点为4.675.与其他物种14-3-3基因氨基酸序列进行同源性比较分析显示,拟穴青蟹14-3-3基因与斑节对虾14-3-3基因同源性最高(95％),依次为墨吉对虾(93％)、苜蓿切叶蜂(92％).聚类分析表明,拟穴青蟹14-3-3基因氨基酸序列与斑节对虾、墨吉对虾紧密聚为一支.经荧光定量检测,拟穴青蟹14-3-3基因在肝胰腺和肌肉中的表达量较高,其次为鳃、眼柄、心脏和肠,在胃中表达最少.盐度骤变实验结果表明:盐度胁迫24 h后,盐度的下降(5)或者上升(15、20、25、30)都引起了14-3-3基因在鳃中的表达量极显著上升(P＜0.01),盐度变化的幅度越大,14-3-3基因的表达量越多.实验结果为进一步深入研究14-3-3基因的功能及调控机理奠定基础.     

缢蛏ScHsc70 cDNA的分子特性和表达分析

从缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)cDNA文库中筛选出一条热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)同源序列,采用EST扩增和5′RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增方法获得全长cDNA序列,共2 335 bp,包括76 bp的5′非翻译区和309 bp的3′非翻译区,以及1 950 bp的开放阅读框。阅读框共编码649个氨基酸,推算的分子量约为70.89 kD,理论等电点为5.28。氨基酸序列分析结果表明,该基因的氨基酸序列含有HSP70家族的3个签名序列,2个糖基化位点,1个ATP-GTP结合位点,且C末端具有GGXP四肽重复序列以及细胞质特异性调控基序EEVD。该基因是组成型HSC70(Heat shock cognate 70)亚家族基因成员,被命名为ScHsc70。基于氨基酸序列的双壳贝类聚类分析表明,缢蛏与南极帽贝(Laternula elliptica)、文蛤(Meretrix meretrix)的亲缘关系最近。荧光定量表达分析显示,ScHsc70 mRNA在缢蛏水管、鳃、斧足、外套膜、肝和性腺等组织中以不同水平存在,其中在外套膜中的表达量最低,而在水管和肝中的表达量最高。经副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和副鳗弧菌(V.anguillarum)诱导后,ScHsc70 mRNA在缢蛏肝中的水平呈现先升高后下降的变化趋势,且分别在感染后的第20小时和第30小时达到最高。结果提示,缢蛏ScHsc70基因可能参与了对细菌感染的防御反应。     

斑节对虾cyclin G2基因克隆及不同刺激下的表达分析

细胞周期蛋白G2(cyclin G2)是细胞周期中的重要调控因子。该研究初步探讨斑节对虾(Penaeus monodon)细胞周期蛋白G2(Pmcyclin G2)在卵巢发育中的作用,利用RACE技术克隆获得4075bp Pmcyclin G2 c DNA全长,其开放阅读框(ORF)1161bp,编码386个氨基酸。利用荧光定量PCR技术研究了Pmcyclin G2组织表达模式,结果显示,Pmcyclin G2在斑节对虾的心脏、血淋巴、肝胰腺、卵巢等组织中均有表达,其中肌肉中表达量最高;卵巢发育不同阶段Pmcyclin G2的表达分析则表明,Pmcyclin G2在III期表达量最高;注射5-羟色胺(5-HT)能诱导卵巢Pmcyclin G2基因表达升高,多巴胺(DA)则抑制卵巢中Pmcyclin G2基因表达。利用原核表达技术获得了cyclin G2的体外重组蛋白,Western Blot分析证实重组蛋白为cyclin G2蛋白。此结果为进一步研究该蛋白的功能提供了条件。以上研究结果表明,Pmcyclin G2基因可能与斑节对虾卵母细胞发育有密切关系,该结果可为进一步探究斑节对虾卵巢的发育机理提供理论依据。     

青虾Ran基因的克隆、表达及其在卵巢发育中的功能

本研究应用RACE技术克隆了青虾(Macrobrachium nipponensis)Ran(Ras related nuclear protein,Ras相关核蛋白)基因全长cDNA序列,该基因cDNA全长1191 bp,包括218 bp的5'UTR,648 bp的开放阅读框(ORF),405 bp的3'UTR,编码215个氨基酸。青虾Ran基因属于P-loop-NTPase超级家族,拥有PTZ00132跨结构域,多肽分子量约为24.57 kDa,理论等电点7.13。系统进化树分析表明,在动物界进化中非常保守的青虾Ran多肽与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)聚为一支,具有最近的亲缘关系。使用荧光定量PCR技术检测Ran基因在成体青虾不同组织和卵巢不同发育期的表达差异,结果显示,Ran基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在卵巢中最高,是精巢表达量的7~8倍;随着卵巢的发育,Ran基因的表达水平呈现上升趋势,在卵巢消退期又恢复到较低水平。RNA干扰后,实验组Ran基因表达量显著低于对照组(P0.05),同时卵巢发育关键基因Vg(vitellogenin)在卵巢中的表达量也显著低于对照组(P0.05),推测Ran基因参与雌性卵巢发育过程并对Vg基因的表达起到调控作用。     

斑节对虾增殖细胞核抗原基因克隆及表达分析

为研究增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的功能,利用RACE技术克隆得到了斑节对虾PCNA基因(PmPCNA)的cDNA全长序列。该序列全长978 bp,包括135 bp的5′非编码区(5′UTR)、60 bp的3′UTR和编码260个氨基酸的783 bp的开放阅读框(ORF)。同源性分析结果表明,PmPCNA与其他物种具有很高的蛋白同源性。组织表达模式分析表明,PmPCNA在所监测的各组织中为组成性表达,其中在卵巢和脑中表达量较高;卵巢发育不同阶段基因的表达分析则表明PmPCNA在Ⅲ期表达量最高,是其他各期表达量的2倍;注射五羟色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)后,PmPCNA在卵巢中表达量明显上升,其中在48 h表达量升高幅度最大,是对照组的5倍左右。利用原核表达技术获得了PCNA的体外重组蛋白,Western Blot分析证实该重组蛋白为PCNA蛋白。以上研究结果表明,PmPCNA蛋白是斑节对虾卵巢发育过程中的重要调节因子,本研究为进一步认识斑节对虾卵巢发育机制提供了基础资料。     

半滑舌鳎骨形态发生蛋白4基因的克隆和表达分析

本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)骨形态发生蛋白4(BMP4)基因的c DNA序列,并分析其在半滑舌鳎成鱼的组织表达分布及其在早期发育阶段的定位和表达变化趋势。结果表明,半滑舌鳎BMP4基因c DNA全长为1680 bp,包括了419 bp的5′非翻译区(5′UTR)、编码403个氨基酸的1212 bp的开放阅读框(ORF)以及49 bp的3′非翻译区(3′UTR)。同源性分析和分子进化聚类分析结果显示,半滑舌鳎与已报道慈鲷科(Cichlidae)各鱼种的同源性最高,并与之共同聚为鱼类BMP4分支。BMP4 m RNA在半滑舌鳎成鱼的13个组织中具有广泛的分布,并在鳃组织中表达量最高,其次在背鳍、软骨等组织具有中等水平的表达。此外,BMP4基因在早期胚胎发育阶段(卵裂期和原肠期)具有极高水平的表达,此后其表达水平逐渐降低;但在后期仔鱼期(孵化后3日龄和4日龄),其表达水平再次升高。整体原位杂交检测结果表明,BMP4 m RNA在早期仔鱼期主要在头部及躯干前部表达;后期仔鱼BMP4基因主要在冠状幼鳍、上下颌及胸鳍处表达;进入稚鱼期后在鳃盖骨及各鳍均有表达。上述研究结果揭示了BMP4在半滑舌鳎早期骨骼发育中的重要作用,为揭示海水硬骨鱼类骨骼发生、发育的调控机制奠定了理论基础。     

中华绒螯蟹脂肪酸延长酶(ELOVL)基因全长cDNA 的克隆及其表达分析

根据脂肪酸延长酶保守区序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)脂肪酸延长酶(ELOVL)基因全长(Gen Bank登录号:KR005628)。分析ELOVL序列表明,该基因c DNA全长2089 bp,开放阅读框(ORF)长1065 bp(包含终止密码子),编码的354个氨基酸具有典型的延长酶特征:1个高度保守的氧化还原中心组氨酸簇HVIHH,多个保守区和多个跨膜区(KFTEFLDT、NTFVHIVMYVYY、TNFQMI)。经氨基酸同源性和系统发育树分析,中华绒螯蟹ELOVL预测氨基酸序列与顶切叶蚁(Acromyrmex echinatior)ELOVL氨基酸序列相似性最高,为59%;同时与家蝇(Musca domestica)聚为一支,进而与日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)等聚为一大支。通过实时荧光定量PCR技术研究ELOVL m RNA在中华绒螯蟹不同组织中的表达量,及投喂不同配合饲料后在可食部位组织中的表达情况。结果显示,ELOVL在各组织中均有表达,在肝胰腺和肠道中表达量最高,心脏中最低,其他组织中少量表达。养殖98 d后分析表明,卵巢和肝胰腺组织中ELOVL m RNA在SO饲料组中表达量最高,并且表达水平随着饲料中鱼油(富含n-3 PUFA)比例减少、豆油(缺少n-3 PUFA)比例增加而显著升高(P0.05);精巢组织中ELOVL m KNA表达量在SO饲料组中最高;肌肉组织中ELOVL m KNA表达水平较低,且各饲料组间表达量差异不显著(P0.05)。以上结果表明,中华绒螯蟹存在ELOVL基因,并且ELOVL的表达受饲料脂肪水平的影响,这为探究中华绒螯蟹自身合成HUFA途径及调节机制奠定了基础。     

金钱鱼促性腺激素受体基因克隆及其在性腺发育不同时期mRNA表达水平的分析

为了解金钱鱼促性腺激素受体基因(GtHRs)在金钱鱼性腺发育中的作用,采用反转录PCR(Rt-PCR)与cDNA末端快速克隆(RACE)首次克隆了金钱鱼卵泡刺激素受体(FSHR)和促黄体生成素受体(LHR)的cDNA序列全长。FSHR的cDNA全长2538 bp,编码702个氨基酸,LHR的cDNA全长3315 bp,编码722个氨基酸,它们都含有属于糖蛋白激素受体(GHR)家族的典型跨膜螺旋结构区域(TM helix)。同源性分析显示金钱鱼GtHRs与欧洲鲈的相似性最高,且GtHRs在进化中具有一定的保守性。性腺不同时期表达分析表明,在卵巢Ⅰ期时,FSHR高水平表达,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期时在较低水平表达。在精巢中,FSHR的表达水平在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期逐渐升高并在Ⅲ期达到最高,Ⅳ期开始下降。LHR在金钱鱼卵巢和精巢的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期低水平表达,在Ⅳ期表达水平达到最高。研究表明,FSHR在金钱鱼性腺发育早期扮演重要作用,LHR与卵子和精子的成熟有关。     

兴国红鲤AR基因的鉴定及MT暴露对幼鱼肝中AR和vtg表达的影响

实验克隆了兴国红鲤(Cyprinus carpio var singuonensis)雄激素受体(androgen receptor,AR)基因的全长c DNA序列和卵黄蛋白原(vitellogenin,vtg)基因的部分c DNA序列,并对雌性个体组织及甲基睾丸酮(Methyltestosterone,MT)暴露下幼鱼肝胰腺(以下简称:肝)中AR和vtg的表达进行检测。兴国红鲤AR基因c DNA全长3 229 bp,包括104 bp的5'非编码区(untranslation region,UTR)、编码846个氨基酸的2 541 bp开放阅读框(open reading frame,ORF)和485 bp 3'UTR。氨基酸序列同源性分析表明,兴国红鲤AR与其他鲤科鱼类AR的同源性较高。组织表达特征研究表明,AR在雌性个体的肝、卵巢、中肾、肌肉和端脑中有表达,其中肝中的表达量最高;vtg主要在肝、端脑和鳃中表达。兴国红鲤幼鱼在50μg/L的MT中暴露4周后,采用qRT-PCR检测了肝中AR和vtg的表达情况。在处理第1、2周,AR的表达受到一定的抑制,而在第3、4周其表达量升高,但其表达无显著性变化;而vtg的表达量在第3、4周均有极显著的升高。