斑节对虾细胞周期蛋白T基因的克隆和表达分析

真核生物的转录调控多发生在转录的延伸阶段,细胞周期蛋白T(cyclin T)是细胞转录的重要调控因子。文章利用RACE技术获得斑节对虾(Penaeus monodon)cyclin T(Pmcyclin T)c DNA全长,其全长为3 421 bp,其中开放阅读框(ORF)3 135 bp,编码1 044个氨基酸;生物信息学分析显示,该氨基酸序列含有一个周期蛋白家族特有的CYCLIN保守区,并含有N-糖基化位点和磷酸化位点;经BLAST同源性分析显示,细胞周期蛋白T编码的蛋白与柑橘木虱(Diaphorina citri)、切叶蚁(Acromyrmex echinatior)等多种节肢动物有很高的同源性;利用qRTPCR技术对Pmcyclin T在不同组织及卵巢发育各时期的mRNA水平的表达谱进行了研究。结果表明,细胞周期蛋白T在斑节对虾的心、卵巢等7个组织中均有表达,其中卵巢中表达量显著高于其他组织(P0.05);在卵巢发育各时期中,细胞周期蛋白T在Ⅲ期表达量最高。     

斑节对虾细胞周期蛋白Y基因克隆与原核表达

为了研究细胞周期蛋白Y(cyclin Y)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的作用,从斑节对虾转录组数据中筛选获得cyclin Y基因部分序列,采用SMART-RACE方法克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白Y(Pm-cyclin Y)基因c DNA全序列。Pm-cyclin Y基因c DNA全长1576 bp,其中包含108 bp的5′非编码区(5′UTR)和439 bp的3′非编码区(3′UTR)以及1029 bp的开放阅读框(ORF),可编码342个氨基酸。生物信息学分析显示,其编码的氨基酸序列有1个保守的周期蛋白框(cyclin box)同源结构域(172~257 aa),预测的分子量约为37.6 k D,理论等电点6.64。实时定量PCR显示其m RNA在卵巢的表达量显著高于其他组织(P0.05);并且在卵巢5个不同发育期都有表达,在III期卵巢中的表达量最高。本研究通过原核表达方法对Pm-cyclin Y进行重组表达,为其蛋白质功能方面的研究奠定了基础。     

斑节对虾增殖细胞核抗原基因克隆及表达分析

为研究增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的功能,利用RACE技术克隆得到了斑节对虾PCNA基因(PmPCNA)的cDNA全长序列。该序列全长978 bp,包括135 bp的5′非编码区(5′UTR)、60 bp的3′UTR和编码260个氨基酸的783 bp的开放阅读框(ORF)。同源性分析结果表明,PmPCNA与其他物种具有很高的蛋白同源性。组织表达模式分析表明,PmPCNA在所监测的各组织中为组成性表达,其中在卵巢和脑中表达量较高;卵巢发育不同阶段基因的表达分析则表明PmPCNA在Ⅲ期表达量最高,是其他各期表达量的2倍;注射五羟色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)后,PmPCNA在卵巢中表达量明显上升,其中在48 h表达量升高幅度最大,是对照组的5倍左右。利用原核表达技术获得了PCNA的体外重组蛋白,Western Blot分析证实该重组蛋白为PCNA蛋白。以上研究结果表明,PmPCNA蛋白是斑节对虾卵巢发育过程中的重要调节因子,本研究为进一步认识斑节对虾卵巢发育机制提供了基础资料。     

斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析

为了研究含硒谷胱甘肽过氧化物酶(selenium-dependent glutathione peroxidase,SeGPx)在斑节对虾应激反应和卵巢发育中的作用,实验以斑节对虾肝胰腺转录组数据中筛选获得的Se-GPx基因(Pm Se-GPx)片段为基础,利用RACE技术获得Pm Se-GPx基因的c DNA全长,并对其进行了生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究了Pm Se-GPx在斑节对虾不同组织、卵巢发育各期、肝胰腺组织在pH9、硫酸铜(Cu~(2+))应激下的相对表达量和变化趋势。结果显示,Pm Se-GPx基因c DNA全长为959 bp,5'非编码区(UTR)长10bp,开放阅读框(ORF)长639 bp,编码212个氨基酸,310 bp的3'UTR包含一个硒代半胱氨酸插入序列(SECIS),ORF中的密码子209TGA211编码硒代半胱氨酸(selenocysteine,U67)。实时定量PCR实验结果表明,Pm Se-GPx在斑节对虾的肝胰腺、卵巢、精巢、心脏等组织中均有表达,其中肝胰腺中表达量显著高于其他组织,卵巢次之;卵巢发育阶段表达结果则显示Pm Se-GPx在卵巢发育各期均有表达,在卵巢Ⅲ期表达量最高,其次是V期;在Cu~(2+)胁迫下,其表达量总体呈现先下降后上升然后又下降的趋势;在环境pH为9胁迫下,表达趋势呈现先下降,后回升,然后又下降,再大幅上升的趋势。研究表明,SeGPx在斑节对虾卵巢发育过程中具有重要作用,且Se-GPx参与斑节对虾对环境理化因子应激的免疫调控。     

斑节对虾泛素融合蛋白UbS27基因克隆与表达分析

从构建的斑节对虾(Penaeus monodon)肝胰腺转录组数据中筛选出泛素核糖体融合蛋白Ub S27基因(ubiquitin/ribosomal S27 fusion protein,Pm Ub S27)片段,利用SMART-RACE技术克隆出Pm Ub S27基因c DNA全长,并利用软件对其结构进行分析;利用实时荧光定量技术检测Pm Ub S27基因在斑节对虾不同组织及卵巢不同发育期的表达情况。结果显示,Pm Ub S27基因c DNA全长为514 bp,开放阅读框465 bp,编码154个氨基酸,含有泛素(1~72 aa)和核糖体蛋白(101~147 aa)2个结构域。以DNA为模板克隆得到的基因序列由3个内含子和4个外显子组成。实时荧光定量结果显示,Pm Ub S27基因在斑节对虾各组织中均有表达,但是在卵巢中表达量最高,其次为肝胰腺、血淋巴和精巢。Pm Ub S27在卵巢发育前期(Ⅱ期)和成熟期(Ⅴ期)的表达量显著高于其他各期(P0.05)。结果表明,Pm Ub S27参与斑节对虾卵巢发育的过程并可能在卵巢发育进程中起到重要的调控作用。     

斑节对虾GLUT1基因cDNA的克隆与表达分析

该研究利用RACE技术克隆获得了斑节对虾(Penaeus monodon) GLUT1 (glucose transporter type 1)的cDNA全长序列;采用实时荧光定量的方法研究了PmGLUT1在斑节对虾幼体发育过程中、各个组织中及低盐胁迫下的差异表达情况。该基因cDNA开放阅读框(ORF)全长1 476 bp,可编码491个氨基酸。检测PmGLUT1基因从受精卵至仔虾期发育过程的表达情况,结果显示,PmGLUT1在幼体发育各期的表达量有所波动,但总体呈现上升趋势。组织表达分析发现,PmGLUT1在鳃组织中的表达量最高,肝胰腺次之,在卵巢中的表达量最低。急性低盐胁迫后,PmGLUT1在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组(P0.05),但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P0.05)。研究结果表明,Pm GLUT1可能在斑节对虾幼体发育及机体应对低盐胁迫过程中具有重要作用,这为进一步研究葡萄糖转运蛋白基因在斑节对虾幼体发育调控和耐低盐胁迫应答中的分子机制提供了理论依据。     

凡纳滨对虾核自身抗原精子蛋白基因克隆及其表达

利用cDNA末端快速扩增技术克隆出凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)核自身抗原精子蛋白(NASP)基因,NASP基因c DNA全长2258 bp,其中包括92 bp 5′端非编码区,147 bp 3′端非编码区及2019 bp开放阅读区,编码673个氨基酸,预测分子量为74.18 k D。该序列已提交至Gen Bank,序列号为KT274811。在NCBI上进行序列比对后发现,其与斑节对虾(Penaeus monodon)NASP序列相似性最高,为90%。采用荧光定量PCR方法测定了不同发育时期卵巢与肝胰腺中NASP m RNA相对表达水平,结果表明,NASP在卵巢中的表达量高于肝胰腺中的表达量,且在Ⅱ期表达量最高,Ⅲ期表达量最低。此外,通过构建系统进化树比较了凡纳滨对虾NASP与其他物种间的遗传距离。实验结果为进一步研究该基因在凡纳滨对虾卵巢发育中的作用提供了依据。     

斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析

研究以斑节对虾(Penaeus monodon)转录组获得的几丁质酶基因(Pm Chi)片段,运用RACE技术克隆了PmChi基因c DNA全长,命名为PmChi-2。PmChi-2基因c DNA全长2 050 bp,其中5'-非编码区(5'-UTR)144 bp、3'-UTR 319 bp和开放阅读框(ORF)1 587 bp,编码528个氨基酸。生物信息学分析显示,PmChi-2与其他甲壳动物Chi-2的相似性为78%~97%。实时荧光定量PCR结果显示,PmChi-2在蜕皮前期(D期)表皮中表达水平最高,在胃、鳃、腹神经节和眼柄中表达水平依次降低,在其他组织(肝胰腺、肠、肌肉、心脏)中几乎不表达。不同蜕皮阶段,PmChi-2在鳃、胃和表皮3种组织中的表达变化模式基本一致,均在蜕皮期(E期)表达量最低,而最高表达量在鳃中出现在蜕皮后期(A期),在胃和表皮中为D期。幼体不同发育阶段分析揭示PmChi-2 mRNA在幼体发育阶段的无节幼体到糠虾幼体第二期表达量维持在一个低水平,在糠虾幼体第三期PmChi-2 mRNA表达水平显著升高,在仔虾期又显著下降,推测PmChi-2 mRNA可能与斑节对虾幼体发育密切相关。研究结果表明PmChi-2基因可能在斑节对虾蜕皮以及幼体的变态发育中发挥重要作用,为深入研究斑节对虾几丁质酶发育调控提供了重要信息。     

斑节对虾组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

通过克隆得到斑节对虾(Penaeus monodon)组织蛋白酶L基因(PmCatL)cDNA全长。该基因序列全长1 850bp,包括1 026 bp的开放阅读框,编码341个氨基酸。预测的PmCatL蛋白由信号肽(Met~1-Ala~(18))、前体域(Val~(19)-Gln~(123))和成熟域(Leu~(124)-Val~(341))三部分构成,存在3个半胱氨酸蛋白酶活性位点(Cys~(148)、His~(287)、Asn~(308))和1个潜在的糖基化位点(Asn~(99))。具有组织蛋白酶L的E~(45)X_3RX_3FX_2NX_3IX_3N~(64)和G~(187)CXGG~(192)保守序列。同源性分析显示,PmCatL氨基酸序列与其他物种相似性为36%~75%。进化树显示PmCatL和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)亲缘关系最近,并与其他无脊椎动物的组织蛋白酶L聚成一支。表达结果表明,PmCatL基因在肝胰腺、淋巴、肌肉、性腺等被测组织中均有表达,其中淋巴和肝胰腺的表达量较高;PmCatL基因在斑节对虾仔虾时期表达量较高,可能与斑节对虾在这一时期的生长发育相关;PmCatL在卵巢发育的Ⅳ期表达量最高,可能在斑节对虾的卵巢发育中发挥重要作用。     

斑节对虾天门冬氨酸转氨酶基因的克隆及氨氮胁迫条件下的表达分析

为了探索天门冬氨酸转氨酶(AST)在斑节对虾(Penaeus monodon)氨氮(NH3-N)解毒代谢中的作用,该研究利用RACE技术获得了斑节对虾AST基因(PmAST)的cDNA全长序列,进行了相关生物信息学分析,在此基础上采用荧光定量与氨氮胁迫实验的方法研究了PmAST基因在斑节对虾的不同组织以及不同浓度氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 957 bp,开放阅读框(ORF)为1 242 bp,3'非编码区(UTR)为584 bp,包括含有30个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为131 bp。ORF可编码413个氨基酸,预测分子量为45.852 kD,理论等电点为8.85。序列含有1个AAT-like超家族结构域、15个磷酸化位点和2个糖基化位点。PmAST的mRNA在斑节对虾各组织中都有表达,在肝胰腺中表达量最高,其次为鳃组织,在胃和脑组织中的表达量最低。96 h氨氮胁迫后荧光定量PCR分析结果表明,PmAST在肝胰腺和鳃组织中都具有不同程度的表达上调,显著高于对照组(P0.05)。研究结果表明斑节对虾的PmAST基因在氨氮胁迫条件下会出现表达上调,并且氨氮浓度越高其上调幅度也越大,所以PmAST参与了斑节对虾的急性氨氮胁迫应答。     

斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)获得了斑节对虾(Penaeus monodon)谷氨酸脱氢酶基因(PmGDH)的cDNA序列。该序列全长2386 bp,开放阅读框(ORF)为1677 bp,3?非编码区(UTR)为688 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5?非编码区(UTR)为21 bp。ORF可编码558个氨基酸,预测分子量为61.837 kD,理论等电点为6.57。序列含有ELFV dehydrog N与NAD bind 1 Glu DH两个保守结构域,37个磷酸化位点,3个糖基化位点。通过同源性、相似性以及系统进化树分析,斑节对虾的GDH基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)GDH基因的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了PmGDH基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。结果表明, PmGDH的mRNA在各组织中都有表达,其中,在肌肉组织中表达量最高,其次为眼柄神经,在血淋巴与肠组织中表达量最低。96 h氨氮胁迫后,荧光定量PCR分析结果表明PmGDH在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比都具有显著差异(P<0.05),都具有不同程度的表达上调。表明PmGDH在氨氮代谢方面具有重要的作用,参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。     

Cloning,characterization, expression analysis and RNAi of Retinoblastoma‐like gene from black tiger shrimp (Penaeus monodon)

Retinoblastoma (Rb) is a multifunctional regulator involved in several key cellular processes, such as cell cycle control, cell differentiation, tumorigenesis and senescence. In this study, an Rb‐like gene, PmRBL, was cloned from black tiger shrimp (Penaeus monodon). The full‐length cDNA sequence of PmRBL is 4,069 bp with an open reading frame of 3,243 bp, which encodes 1,080 amino acids. Quantitative real‐time PCR (qRT‐PCR) analysis indicated that PmRBL was highly expressed in the gills, hepatopancreas and ovaries of P. monodon. The highest PmRBL expression levels were observed in stage III of the ovarian development in P. monodon. RNA interference experiments were conducted to examine the expression profiles of PmRBL, PmCDK2 and PmCyclin E. The knockdown of PmRBL in the ovary and hepatopancreas by dsRNA‐RBL was successful. After dsRNA‐RBL was injected into the shrimp, the relative expression levels of PmCDK2 and PmCyclin E were upregulated at 12–72 hr in the ovaries and hepatopancreas. The localization and level of PmRBL expression in the ovary and hepatopancreas were investigated through in situ hybridization, which revealed consistent results with those of qRT‐PCR. Therefore, PmRBL, PmCDK2 and PmCyclin E may be involved in vitellogenin synthesis and ovarian maturation in P. monodon.     

切除单侧眼柄对不同体质量养殖斑节对虾卵巢发育及产卵的影响

在盐度31、水温28~29℃下,进行了4次卵巢诱导试验,研究了切除单侧眼柄对体质量56.4~105.4g的养殖斑节对虾卵巢发育和产卵的影响及卵巢发育、产卵与体质量之间的关系。结果显示,切除单侧眼柄诱导养殖斑节对虾卵巢发育成熟,成功率(y)与雌虾体质量(x)显著相关(P0.05),雌虾体质量越小,诱导成功率越低,回归方程为:y=133.92lnx-535.63(r2=0.9297)。养殖斑节对虾眼柄手术后,最快10d产卵,部分雌虾能重复产卵。产卵量(y)与雌虾体质量(x)显著正相关(P0.05),雌虾体质量越小,产卵量越小,回归方程为:y=122.22lnx-472.2(r2=0.9738)。雌虾累积死亡率、卵子直径和卵子孵化率与雌虾体质量无显著相关性(P0.05)。建议用体质量80g以上的养殖斑节对虾雌虾作为亲虾。     

日本沼虾细胞自噬基因ATG13和ATG101的克隆及其低氧胁迫下表达分析

为研究自噬相关基因(autophagy-related genes, ATG) ATG13和ATG101在甲壳动物应答低氧胁迫过程中的调节作用,实验采用RACE PCR技术通过克隆测序和基因序列拼接,首次克隆了日本沼虾的细胞自噬基因ATG13和ATG101的全长cDNA序列,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13 cDNA全长2 043 bp (NCBI登录号为MT084347),包括211 bp的5′末端非翻译区(untranslated region,UTR),449 bp的3′UTR和1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),开放阅读框编码460个氨基酸;ATG101 cDNA全长1 051 bp(NCBI登录号为MT084348),包括18 bp的5′末端非翻译区,373 bp的3′UTR和660 bp的开放阅读框,开放阅读框编码219个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13富含高度保守的LC3作用结构域(LIR);系统进化树分析显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13与凡纳滨对虾ATG13具有最近的亲缘关系;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)实验分析发现,日本沼虾ATG13和ATG101在其肝胰腺和脑组织表达量较高,而在肌肉中表达量较低;利用qRT-PCR追踪其在肝胰腺组织低氧胁迫过程中出现的表达差异情况,结果显示,实验组日本沼虾在低氧胁迫6和24 h时,其细胞自噬基因ATG13和ATG101表达量显著高于对照组,而在复氧12 h后,实验组与对照组的ATG13和ATG101表达量差异不显著;Western blot分析结果显示,日本沼虾ATG13和ATG101表达丰度基本与基因表达模式相似。透射电镜分析结果显示,在低氧胁迫6和24 h后,肝胰腺组织中的溶酶体开始出现自噬空泡,表明急性低氧胁迫会诱导自噬体的形成,本研究结果可为了解日本沼虾应对低氧胁迫下的调控机制提供理论参考。     

Survival and Histological Alterations in Juvenile Tiger Shrimps Exposed to Saponin

Survival and shell quality of juvenile tiger shrimp, Penaeus monodon, exposed to a plant derived toxicant, saponin, were investigated. The 96 h LC₅₀ was 132.07 mg l^-1 of saponin. The juvenile tiger shrimp tested against 5, 10, 15 and 20% concentrations of the 96 h LC₅₀ value of saponin for 3, 6, 9, 12, 15 and 18 days recorded shell softening ranging from 3.33 to 60% of the individuals. The percentage of shell softening in the treated shrimps was dependent on both concentration and duration of exposure. The cuticular layers of soft-shelled shrimps were thinner and often had wrinkled surfaces which usually disrupted and separated from the epidermis. In the hepatopancreas of the soft-shelled shrimps, the major alterations were the degeneration of hepatopancreatic tubules, separation of basal laminae from the tubules and reduced lumen of tubules.     

Response of facilitative glucose transporter 1 to salinity stress and dietary carbohydrate nutrition in white shrimp Litopenaeus vannamei

Facilitative glucose transporter 1 (GLUT1) is a transporter protein for glucose transport via the plasma membrane of the cells to provide energy through carbohydrate metabolism. GLUT1 cDNA from Litopenaeus vannamei was obtained and analysed in this study. Full‐length GLUT1 cDNA is 2062 bp long and contained a 1506‐bp ORF encoding a 502 amino acid protein, a 270‐bp 5′UTR and a 284‐bp 3′UTR. When shrimp were under acute low salinity stress, the expression in hepatopancreas, muscle, gill and eyestalk was all up‐regulated at 12 h (P < 0.05) and 96 h (P < 0.05), while the expression in the four tissues was all down‐regulated at 6 h (P < 0.05) and 48 h (P < 0.05) . The expression in the muscle of shrimp at water salinity of 3 was lower than that at water salinity of 30 independent of dietary carbohydrate levels, while expression in hepatopancreas, gill and eyestalk was up‐regulated at 200 and 300 g kg^?1 carbohydrate levels. The expression in all tissues fed glucose was up‐regulated when compared to the expression in shrimp held at a water salinity of 30. This study suggests that GLUT1 is a conserved protein in L. vannamei, and changes in expression due to environmental salinity and dietary carbohydrate level and source.     

Infection of the yellow head baculo-like virus (YBV) in two species of penaeid shrimp, Penaeus stylirostris (Stimpson) and Penaeus vannamei (Boone)

Abstract. Yellow head baculo-like virus infection and disease were demonstrated experimentally in the two main species of penaeid shrimp cultured in Hawaii and the Western hemisphere. Viral infection was induced by intramuscular inoculation of a 10% suspension of cephalothorax tissue filtrate prepared from two tiger shrimp, Penaeus monodon Fabricius, infected with yellow head disease, into sub-adult (3–10g) P. stylirostris (Stimpson) and P. vannamei (Boone). Signs of disease appeared as early as 2 days post infection (p.i.), and in most cases mortality reached 100% within 5–7 days p.i. Histopathological examination of the infected animals revealed extensive cellular necrosis in ectodermal and some mesenchymal tissues. Electron microscopical examination of thin sections of the gill and hepatopancreas from the infected shrimp revealed non-occluded rod-shaped baculo-like virus particles measuring 130–197 & 45–58 nm which were primarily localized within the cytoplasm of infected cells. The virus particles were contained within cytoplasmic vacuoles, and occurred singly or in small groups of two or more particles.     

南通地区海蜇、斑节对虾和缢蛏的生态混养

在江苏省南通市水深2m、面积467km~2的池塘中,每667m~2放养伞径5cm的海蜇Rhopilemae sculentum200只、全长1cm左右的斑节对虾Penaeus monodon 4000尾和4 000粒/kg的缢蛏Sinonovacula constrzcta 20万粒。经饲养,海蜇产量为855kg/km~2、斑节对虾67kg/km~2、缢蛏145kg/km~2,总产量为1 067kg/km~2,产值为8 600元,利润为6 057元,显示出较高的生态和社会效益。