斑节对虾细胞周期蛋白Y基因克隆与原核表达

为了研究细胞周期蛋白Y(cyclin Y)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的作用,从斑节对虾转录组数据中筛选获得cyclin Y基因部分序列,采用SMART-RACE方法克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白Y(Pm-cyclin Y)基因c DNA全序列。Pm-cyclin Y基因c DNA全长1576 bp,其中包含108 bp的5′非编码区(5′UTR)和439 bp的3′非编码区(3′UTR)以及1029 bp的开放阅读框(ORF),可编码342个氨基酸。生物信息学分析显示,其编码的氨基酸序列有1个保守的周期蛋白框(cyclin box)同源结构域(172~257 aa),预测的分子量约为37.6 k D,理论等电点6.64。实时定量PCR显示其m RNA在卵巢的表达量显著高于其他组织(P0.05);并且在卵巢5个不同发育期都有表达,在III期卵巢中的表达量最高。本研究通过原核表达方法对Pm-cyclin Y进行重组表达,为其蛋白质功能方面的研究奠定了基础。     

斑节对虾cyclin G2基因克隆及不同刺激下的表达分析

细胞周期蛋白G2(cyclin G2)是细胞周期中的重要调控因子。该研究初步探讨斑节对虾(Penaeus monodon)细胞周期蛋白G2(Pmcyclin G2)在卵巢发育中的作用,利用RACE技术克隆获得4075bp Pmcyclin G2 c DNA全长,其开放阅读框(ORF)1161bp,编码386个氨基酸。利用荧光定量PCR技术研究了Pmcyclin G2组织表达模式,结果显示,Pmcyclin G2在斑节对虾的心脏、血淋巴、肝胰腺、卵巢等组织中均有表达,其中肌肉中表达量最高;卵巢发育不同阶段Pmcyclin G2的表达分析则表明,Pmcyclin G2在III期表达量最高;注射5-羟色胺(5-HT)能诱导卵巢Pmcyclin G2基因表达升高,多巴胺(DA)则抑制卵巢中Pmcyclin G2基因表达。利用原核表达技术获得了cyclin G2的体外重组蛋白,Western Blot分析证实重组蛋白为cyclin G2蛋白。此结果为进一步研究该蛋白的功能提供了条件。以上研究结果表明,Pmcyclin G2基因可能与斑节对虾卵母细胞发育有密切关系,该结果可为进一步探究斑节对虾卵巢的发育机理提供理论依据。     

凡纳滨对虾核自身抗原精子蛋白基因克隆及其表达

利用cDNA末端快速扩增技术克隆出凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)核自身抗原精子蛋白(NASP)基因,NASP基因c DNA全长2258 bp,其中包括92 bp 5′端非编码区,147 bp 3′端非编码区及2019 bp开放阅读区,编码673个氨基酸,预测分子量为74.18 k D。该序列已提交至Gen Bank,序列号为KT274811。在NCBI上进行序列比对后发现,其与斑节对虾(Penaeus monodon)NASP序列相似性最高,为90%。采用荧光定量PCR方法测定了不同发育时期卵巢与肝胰腺中NASP m RNA相对表达水平,结果表明,NASP在卵巢中的表达量高于肝胰腺中的表达量,且在Ⅱ期表达量最高,Ⅲ期表达量最低。此外,通过构建系统进化树比较了凡纳滨对虾NASP与其他物种间的遗传距离。实验结果为进一步研究该基因在凡纳滨对虾卵巢发育中的作用提供了依据。     

斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析

为了研究含硒谷胱甘肽过氧化物酶(selenium-dependent glutathione peroxidase,SeGPx)在斑节对虾应激反应和卵巢发育中的作用,实验以斑节对虾肝胰腺转录组数据中筛选获得的Se-GPx基因(Pm Se-GPx)片段为基础,利用RACE技术获得Pm Se-GPx基因的c DNA全长,并对其进行了生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究了Pm Se-GPx在斑节对虾不同组织、卵巢发育各期、肝胰腺组织在pH9、硫酸铜(Cu~(2+))应激下的相对表达量和变化趋势。结果显示,Pm Se-GPx基因c DNA全长为959 bp,5'非编码区(UTR)长10bp,开放阅读框(ORF)长639 bp,编码212个氨基酸,310 bp的3'UTR包含一个硒代半胱氨酸插入序列(SECIS),ORF中的密码子209TGA211编码硒代半胱氨酸(selenocysteine,U67)。实时定量PCR实验结果表明,Pm Se-GPx在斑节对虾的肝胰腺、卵巢、精巢、心脏等组织中均有表达,其中肝胰腺中表达量显著高于其他组织,卵巢次之;卵巢发育阶段表达结果则显示Pm Se-GPx在卵巢发育各期均有表达,在卵巢Ⅲ期表达量最高,其次是V期;在Cu~(2+)胁迫下,其表达量总体呈现先下降后上升然后又下降的趋势;在环境pH为9胁迫下,表达趋势呈现先下降,后回升,然后又下降,再大幅上升的趋势。研究表明,SeGPx在斑节对虾卵巢发育过程中具有重要作用,且Se-GPx参与斑节对虾对环境理化因子应激的免疫调控。     

斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)获得了斑节对虾(Penaeus monodon)谷氨酸脱氢酶基因(PmGDH)的cDNA序列。该序列全长2386 bp,开放阅读框(ORF)为1677 bp,3?非编码区(UTR)为688 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5?非编码区(UTR)为21 bp。ORF可编码558个氨基酸,预测分子量为61.837 kD,理论等电点为6.57。序列含有ELFV dehydrog N与NAD bind 1 Glu DH两个保守结构域,37个磷酸化位点,3个糖基化位点。通过同源性、相似性以及系统进化树分析,斑节对虾的GDH基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)GDH基因的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了PmGDH基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。结果表明, PmGDH的mRNA在各组织中都有表达,其中,在肌肉组织中表达量最高,其次为眼柄神经,在血淋巴与肠组织中表达量最低。96 h氨氮胁迫后,荧光定量PCR分析结果表明PmGDH在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比都具有显著差异(P<0.05),都具有不同程度的表达上调。表明PmGDH在氨氮代谢方面具有重要的作用,参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。     

斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得了斑节对虾(Penaeus monodon)谷氨酸脱氢酶基因(PmGDH)的cDNA序列。该序列全长2386 bp,开放阅读框(ORF)为1677 bp,3'非编码区(UTR)为688 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为21 bp。ORF可编码558个氨基酸,预测分子量为61.837 k D,理论等电点为6.57。序列含有ELFV dehydrog N与NAD bind 1 Glu DH两个保守结构域,37个磷酸化位点,3个糖基化位点。通过同源性、相似性以及系统进化树分析,斑节对虾的GDH基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)GDH基因的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了PmGDH基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。结果表明,PmGDH的m RNA在各组织中都有表达,其中,在肌肉组织中表达量最高,其次为眼柄神经,在血淋巴与肠组织中表达量最低。96 h氨氮胁迫后,荧光定量PCR分析结果表明PmGDH在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比都具有显著差异(P0.05),都具有不同程度的表达上调。表明PmGDH在氨氮代谢方面具有重要的作用,参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。     

斑节对虾真核生物翻译起始因子3亚基4（btseIF3g）序列分析及组织表达特性

通过mRNA差异显示(differential display,DD)技术筛选的差异片段,与斑节对虾(Penaeus monodon)混合组织cDNA文库中的EST进行拼接,获得斑节对虾真核生物翻译起始因子3亚基4(btseIF3g)的全序列(GenBank登录号:FJ829364).btseIF3g全长1 041 bp,由72 bp 5′非编码区、90 bp 3′非编码区以及879 bp的开放阅读框组成,推测编码一个长度为292个氨基酸的蛋白.经BLAST分析,btseIF3g C端含有一个RNA识别基序(RNA recognition motif,RRM)的保守结构域(E值为2.72e-25).利用氨基酸序列进行系统发育分析表明,btseIF3g与eIF3g属于同一分支.采用荧光定量PCR(Real-time PCR)方法对250日龄的雌、雄斑节对虾不同组织表达特性研究发现,btseIF3g在眼柄神经节、脑神经、肝胰腺、性腺和肌肉组织中均有表达,在卵巢中的相对表达量极显著(P<0.01)高于其他组织,这一结果提示eIF3g可能与斑节对虾卵巢发育相关.     

斑节对虾细胞周期蛋白T基因的克隆和表达分析

真核生物的转录调控多发生在转录的延伸阶段,细胞周期蛋白T(cyclin T)是细胞转录的重要调控因子。文章利用RACE技术获得斑节对虾(Penaeus monodon)cyclin T(Pmcyclin T)c DNA全长,其全长为3 421 bp,其中开放阅读框(ORF)3 135 bp,编码1 044个氨基酸;生物信息学分析显示,该氨基酸序列含有一个周期蛋白家族特有的CYCLIN保守区,并含有N-糖基化位点和磷酸化位点;经BLAST同源性分析显示,细胞周期蛋白T编码的蛋白与柑橘木虱(Diaphorina citri)、切叶蚁(Acromyrmex echinatior)等多种节肢动物有很高的同源性;利用qRTPCR技术对Pmcyclin T在不同组织及卵巢发育各时期的mRNA水平的表达谱进行了研究。结果表明,细胞周期蛋白T在斑节对虾的心、卵巢等7个组织中均有表达,其中卵巢中表达量显著高于其他组织(P0.05);在卵巢发育各时期中,细胞周期蛋白T在Ⅲ期表达量最高。     

橘色双冠丽鱼体色相关基因mitf的结构及表达调控特性

为了解小眼畸形相关转录因子mitf基因在鱼类早期体色褪黑过程中的调控作用,本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus) mitf基因cDNA序列全长,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测其在橘色双冠丽鱼胚胎不同发育时期、体色褪黑不同时期和各个组织中的表达规律。获得mitf基因2个亚型,其中,mitf1的cDNA全长为1816 bp,包括5′非编码区(UTR) 158 bp、3′UTR 428 bp、开放阅读框(ORF) 1230 bp,共编码409个氨基酸;mitf2的cDNA全长为1638 bp,包括5´UTR 160 bp、3´UTR 428 bp和ORF 1050 bp,共编码349个氨基酸。同源性和系统进化分析显示,mitf1和mitf2聚在一小支,与慈鲷科(Cichlidae)鱼类同源性最高,与哺乳类动物同源性较低。qRT-PCR结果显示,在成鱼各个组织中,mitf1和mitf2均有不同程度表达,其中,眼部表达量最高且显著高于其他组织(P<0.05),肌肉、脑和肾脏也有较高表达;mitf1和mitf2在胚胎各个发育时期均有表达,在受精卵时期表达量最高,显著高于其他胚胎期;随着橘色双冠丽鱼体色由黑色过渡到橘黄色,mitf1和mitf2在鱼皮肤、鳞片、尾鳍中的表达均呈逐渐下降的趋势,表明mitf基因表达与鱼体色由黑到黄转变的表型间存在关联性,推测与鱼体色发育阶段色素细胞的分化和分布比例的动态变化相关。本研究通过了解鱼类体色发育和变异的分子基础,可为鱼类色素细胞发育和体色人工改良积累资料。     

三疣梭子蟹细胞Cdk7基因克隆及其在卵巢发育中的表达

本实验应用RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)周期蛋白依赖性激酶7(Cdk7)基因c DNA序列全长。基因5′和3′非编码区域(UTR)以及开放阅读框的长度分别是23 bp、178 bp和1056 bp,预测编码一个含有351个氨基酸,分子量为39.91 k D的蛋白质,包含一个丝氨酸/苏氨酸催化保守结构域和T-loop结构。同源性分析表明,三疣梭子蟹CDK7氨基酸序列与其他物种Cdk7相似度较高,说明Cdk7基因具有很好的保守性。实时荧光定量PCR结果显示,三疣梭子蟹Cdk7基因在卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P0.05)。Cdk7基因在卵巢发育不同时期的表达量存在差异,其在I期和Ⅱ期的表达量显著高于其他时期(P0.05)。去除眼柄后该基因在卵巢组织中的表达呈现先升高后降低的趋势,并于第4天达到最大值。本研究的结果表明,Cdk7基因参与了三疣梭子蟹卵巢发育调控,为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物性腺发育调控机理研究提供了重要信息。     

脊尾白虾VgR基因克隆及其在卵巢发育过程中的表达分析

为了解卵黄蛋白原受体(vitellogenin receptor,Vg R)在脊尾白虾卵巢发育中的作用,采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾Vg R基因全长c DNA序列,用实时荧光定量PCR方法分析了Vg R基因在雌虾不同组织、卵巢发育不同时期的表达特征。结果显示,脊尾白虾Vg R基因全长5892 bp,开放阅读框5661 bp,编码1886个氨基酸。脊尾白虾Vg R具有低密度脂蛋白受体(LDLR)家族典型结构特征,属于LDLR家族,进化上与日本沼虾等甲壳动物Vg R亲缘关系最近,然后与昆虫Vg R分支聚为一支,而与LDLR家族中其他成员亲缘关系较远。脊尾白虾Vg R在各组织中均有表达,但主要在卵巢内表达。随着卵巢的发育,卵巢Vg R表达量逐渐升高,在III期达到最大,与肝胰腺Vg表达量、血液Vg浓度变化趋势相一致;而在卵巢成熟时,卵巢Vg R表达量降到了最低,与肝胰腺Vg表达情况截然相反;排卵后的恢复期,血液中Vg浓度仍维持在较高水平,卵巢Vg R表达量又升至III期水平,同时卵巢Vg表达量也升至最高。由此可见,甲壳动物与昆虫Vg R起源于同一祖先,但在进化上已形成独立一支;脊尾白虾卵巢成熟前,卵巢主要通过Vg R介导作用摄取血液中Vg,以供卵巢快速成熟;卵巢成熟期,肝胰腺呈现补偿性合成Vg,以尽快恢复其营养储备功能;卵巢恢复期,卵巢通过Vg R介导摄入外源Vg和内源合成Vg两种途径,为卵巢二次发育提供营养物质。     

Serotonin stimulates ovarian maturation and spawning in the black tiger shrimp Penaeus monodon

Serotonin (5-hydroxytryptamine, 5HT) has been reported to induce ovarian maturation and spawning in the crayfish Procambarus clarkii and white Pacific shrimp Litopenaeus vannamei. The aim of this study was to explore the role of exogenous 5HT on the reproductive performance of the black tiger shrimp Penaeus monodon. 5HT solution was injected into domesticated P. monodon broodstock at 50 μg/g body weight and ovarian maturation and spawning were recorded. The presence of 5HT in the ovary and oviduct of P. monodon was also studied by immunohistochemistry and its levels in the ovary by enzyme link immunoabsorbance assay (ELISA). The 5HT-injected P. monodon developed ovarian maturation and spawning rate at the level comparable to that of unilateral eyestalk-ablated shrimp. Hatching rate and the amount of nauplii produced per spawner were also significantly higher in the 5HT-injected shrimp, compared to the eyestalk-ablated shrimp. 5HT-positive reactions were found in the follicular cells of pre-vitellogenic oocytes, in the cytoplasm of early vitellogenic oocytes and on the cell membrane and cytoplasm of late vitellogenic oocytes. 5HT in the ovary was present at 3.53 ± 0.26 ng/mg protein level in previtellogenic stage and increased to 17.03 ± 0.57 ng/mg protein level in the mature stage of the ovary. The results suggest a significant role of 5HT, possibly directly on the ovary and oviduct, on the reproductive function of female P. monodon.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) gnrh2基因克隆、组织分布及卵巢成熟过程中表达分析

为了研究下丘脑神经肽促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone 2,GnRH2)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢成熟过程中的生理作用,本研究通过RT-PCR及RACE方法获得了半滑舌鳎GnRH2全长cDNA序列;通过实时荧光定量PCR(qPCR)对gnrh2 mRNA的组织分布以及卵巢成熟过程中的时空表达特性进行了分析.结果显示,半滑舌鳎GnRH2全长cDNA序列为538 bp(不包括polyA尾),其中,5'非编码区(Untranslated region,UTR)为154 bp,3'UTR为126 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为258 bp,编码85个氨基酸的前体多肽,其分子量及等电点分别为9.69 kDa和8.55.GnRH2前体多肽由信号肽、GnRH2十肽、酶切位点(GKR)以及GnRH相关肽共4部分组成.序列比对分析发现,GnRH2在鱼类中同源性极高,尤其是十肽(QHWSHGWYPG)在所有硬骨鱼类中完全相同.半滑舌鳎GnRH2与鲈形目同源性最高(89.41％-90.5 9％),其次为鲽形目、鲑形目和鲍形目(78.82％-85.88％),与鲤形目同源性最低(61.18％-71.76％).gnrh2 mRNA主要在脑中表达,在垂体及其他外周组织中表达量极低.此外,组织学分析显示,半滑舌鳎卵巢发育共分为5个时期(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期).在卵巢成熟过程中,脑gnrh2 mRNA表达量在卵黄生成期(Ⅲ期)显著性增加,达到峰值;随后表达量急剧下降,在成熟期(Ⅴ期)达到最小值;在排卵后期(Ⅵ期)又显著性增加.然而,在卵巢成熟过程中,垂体gnrh2 mRNA表达量在卵黄生成后期(Ⅳ期)显著性降低,随后在成熟期(Ⅴ期)有所增加,但在排卵后期(Ⅵ期)又急剧下降.上述研究结果表明,脑GnRH2可能参与了半滑舌鳎卵巢发育过程.     

尼罗罗非鱼Xbp1-S基因克隆及表达分析

为了了解尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)细胞转录因子Xbp1-S(On Xbp1-S)的基因序列特征及其在无乳链球菌(Streptococcus alactolyticus)应激和在B细胞分化中的作用,应用RACE克隆技术获得的On Xbp1-S基因全长1380 bp,包括开放阅读框ORF为1155 bp,5?端非编码区(5?UTR)长127 bp,3?端非编码区(3'UTR)长98 bp。On Xbp1-S序列分析推测该基因编码384个氨基酸,分子量为41.32 k Da,理论等电点为4.36。同源性分析显示,On Xbp1-S基因与其他鱼类的聚为一支,其中,与南极鳕(Notothenia coriiceps)相似性最高。荧光定量PCR及Western-blot结果显示,On Xbp1-S在各组织中均有表达,m RNA水平上在肝脏中表达量最高,蛋白水平上在胸腺中表达量最高,而在肌肉中表达量最低。无乳链球菌应激后,On Xbp1-S基因在肝脏和脾脏中的表达趋势相似,均在应激期间出现表达量上调,在192 h出现峰值。另外,免疫组化分析发现,On Xbp1-S因子在不同分化程度B细胞亚类中的表达呈现差异,在成熟B细胞中呈现高表达,而在未成熟B细胞中几乎不表达。研究结果表明,On Xbp1-S参与尼罗罗非鱼对无乳链球菌的免疫防御,和在B细胞分化中起作用。本研究将为进一步研究On Xbp1-S因子应答病原菌侵染的机理及促进B细胞分化机制提供理论依据。     

青虾冷休克蛋白Y-box编码基因的cDNA全长克隆与表达分析

为研究冷休克蛋白Y-box基因在青虾应答环境胁迫过程中所起的调控作用,实验应用RACE PCR技术首次克隆了青虾的冷休克蛋白Y-box基因全长c DNA序列,并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术对其在青虾不同组织及环境胁迫过程中的表达变化特征进行分析。青虾冷休克蛋白Y-box基因c DNA全长1501 bp,包括84 bp的5′末端非翻译区(UTR),876 bp的开放阅读框(ORF),541 bp的3′UTR,开放阅读框编码291个氨基酸。氨基酸相似度比对显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因富含高度保守的冷休克结构域。系统进化树分析显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因与水蚤等节肢动物冷休克Y-box聚类一支,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,冷休克蛋白Y-box基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺组织中最高,使用荧光定量PCR检测青虾冷休克蛋白Y-box基因在低温胁迫和恢复条件下在肝胰腺中的m RNA时空表达情况,结果显示,与对照组相比冷休克蛋白Y-box在肝胰腺中的表达量分别在低温和低氧胁迫3,6和12 h出现了显著上调,而在恢复刺激后其表达量与对照组差异不显著。此外,本实验对Y-box进行了原核表达,为进一步研究Y-box基因的功能奠定了基础。     

Cloning,characterization, expression analysis and RNAi of Retinoblastoma‐like gene from black tiger shrimp (Penaeus monodon)

Retinoblastoma (Rb) is a multifunctional regulator involved in several key cellular processes, such as cell cycle control, cell differentiation, tumorigenesis and senescence. In this study, an Rb‐like gene, PmRBL, was cloned from black tiger shrimp (Penaeus monodon). The full‐length cDNA sequence of PmRBL is 4,069 bp with an open reading frame of 3,243 bp, which encodes 1,080 amino acids. Quantitative real‐time PCR (qRT‐PCR) analysis indicated that PmRBL was highly expressed in the gills, hepatopancreas and ovaries of P. monodon. The highest PmRBL expression levels were observed in stage III of the ovarian development in P. monodon. RNA interference experiments were conducted to examine the expression profiles of PmRBL, PmCDK2 and PmCyclin E. The knockdown of PmRBL in the ovary and hepatopancreas by dsRNA‐RBL was successful. After dsRNA‐RBL was injected into the shrimp, the relative expression levels of PmCDK2 and PmCyclin E were upregulated at 12–72 hr in the ovaries and hepatopancreas. The localization and level of PmRBL expression in the ovary and hepatopancreas were investigated through in situ hybridization, which revealed consistent results with those of qRT‐PCR. Therefore, PmRBL, PmCDK2 and PmCyclin E may be involved in vitellogenin synthesis and ovarian maturation in P. monodon.