尼罗罗非鱼Xbp1-S基因克隆及表达分析

为了了解尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)细胞转录因子Xbp1-S(On Xbp1-S)的基因序列特征及其在无乳链球菌(Streptococcus alactolyticus)应激和在B细胞分化中的作用,应用RACE克隆技术获得的On Xbp1-S基因全长1380 bp,包括开放阅读框ORF为1155 bp,5?端非编码区(5?UTR)长127 bp,3?端非编码区(3'UTR)长98 bp。On Xbp1-S序列分析推测该基因编码384个氨基酸,分子量为41.32 k Da,理论等电点为4.36。同源性分析显示,On Xbp1-S基因与其他鱼类的聚为一支,其中,与南极鳕(Notothenia coriiceps)相似性最高。荧光定量PCR及Western-blot结果显示,On Xbp1-S在各组织中均有表达,m RNA水平上在肝脏中表达量最高,蛋白水平上在胸腺中表达量最高,而在肌肉中表达量最低。无乳链球菌应激后,On Xbp1-S基因在肝脏和脾脏中的表达趋势相似,均在应激期间出现表达量上调,在192 h出现峰值。另外,免疫组化分析发现,On Xbp1-S因子在不同分化程度B细胞亚类中的表达呈现差异,在成熟B细胞中呈现高表达,而在未成熟B细胞中几乎不表达。研究结果表明,On Xbp1-S参与尼罗罗非鱼对无乳链球菌的免疫防御,和在B细胞分化中起作用。本研究将为进一步研究On Xbp1-S因子应答病原菌侵染的机理及促进B细胞分化机制提供理论依据。     

尼罗罗非鱼γ-干扰素基因的克隆、结构分析及组织表达

γ-干扰素(interferon,IFN)是调控天然免疫与细胞免疫的一种重要细胞因子,在抵抗病毒入侵和细菌感染中发挥重要作用。该研究从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)脾脏组织中扩增到γ-干扰素基因的c DNA,大小为621 bp,编码206个氨基酸。生物信息学分析表明,尼罗罗非鱼γ-干扰素分子(On IFNγ)具有信号肽、IFN特征序列及核定位信号。预测的三级结构与人类IFNγ晶体结构最相似。q PCR检测显示,IFNγ在正常鱼体内的脾脏中表达量最高,其次是肠、鳃和肾脏。感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后,On IFNγ在脾脏、肾和鳃中的表达均显著上调(P0.05)。On IFNγ在相关免疫器官中的高表达、受感染后的表达上调,说明其在罗非鱼免疫防御中可能具有重要作用。该研究为进一步开展On IFNγ基因的功能研究、探讨其在抗病转基因及抗病选育中的开发应用奠定了基础。     

尼罗罗非鱼补体C9基因的克隆和组织表达分析

为了探究补体C9在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫中发挥的作用,本研究克隆并分析了尼罗罗非鱼补体C9基因(OnC9)。结果显示:OnC9的cDNA序列全长2 502 bp,包含1 761 bp的开放阅读框(ORF),编码586个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,OnC9与牙鲆(Paralichthys olivaceus)补体C9氨基酸相似性最高,达73.0%,与其他鱼类补体C9的相似性介于49.3%~71.4%之间。实时荧光定量PCR检测结果表明,OnC9基因在所检测的各个组织或器官中表达水平有明显差异,在肝脏中表达量最高,其次是肠道、后肾、皮肤、肌肉、鳃,在脑、脾脏、心脏、头肾、胸腺和血液中表达量最低。在无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染鱼体后,肝脏、后肾等组织中OnC9表达量表现为在感染12 h、48 h(或36 h)、120 h先后出现三个峰值的波动表达的规律。说明OnC9在无乳链球菌感染尼罗罗非鱼后的免疫应答中发挥作用。     

尼罗罗非鱼p38MAPK基因克隆与表达分析

为了探究p38MAPK与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫功能的相关性,本实验运用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得尼罗罗非鱼埃及品系ntp38MAPK的cDNA全长序列,结果显示,该序列全长1789 bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长1086 bp,5′非编码区(Untranslated Region,UTR)长342 bp,3′UTR为361 bp。ORF编码361个氨基酸,预测分子量为41.598 kD,理论等电点为5.10。序列含有p38家族典型保守的Thr-Gly-Tyr(TGY)双磷酸化位点以及紧密相连的底物结合位点Ala-Thr-Arg-Trp(ATRW)。同源性以及系统进化树分析结果显示,尼罗罗非鱼的p38MAPK与大黄鱼(Larimichthys crocea)和鲈(Dicentrarchus labrax)的相似性最高。采用qRT-PCR的方法研究了ntp38MAPK在各组织以及无乳链球菌感染过程中的表达差异情况,结果显示,ntp38MAPK在各组织均有表达,其中在肌肉的表达量最高,心脏、肝脏、脾脏次之,头肾中的表达量最低。无乳链球菌感染过程中,脾脏、头肾中ntp38MAPK的表达量在2 h开始上调,肝脏中4 h开始上调,8 h后肝脏、脾脏和头肾中的表达量都有所下降,24~72 h趋于平稳,表明ntp38MAPK在尼罗罗非鱼抵抗链球菌侵染过程中发挥重要作用。     

尼罗罗非鱼铁调素调节蛋白在宿主抵御病原菌侵染和调节铁稳态中的功能

为了研究铁调素调节蛋白(hemojuvelin,HJV)在硬骨鱼中抵御病原菌感染和维持自身铁稳态过程中的作用,实验扩增了尼罗罗非鱼铁调素调节蛋白基因(Onhjv)的开放阅读框(ORF),分析其在健康尼罗罗非鱼各组织中的分布模式及在抵御病原菌感染和调节铁稳态中的相关作用。结果显示,Onhjv的ORF全长由1 248个碱基组成,编码415个氨基酸,在不同物种之间具有一定的保守性。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,Onhjv在尼罗罗非鱼各组织中广泛分布,并在肝脏中的表达量最高。在无乳链球菌或嗜水气单胞菌感染后,Onhjv在肝脏、脾脏、肠和鳃中的表达量均显著上调。体外头肾单核/巨噬细胞和肝细胞中Onhjv表达量在受到这2种病原菌应激下也显著上调。此外,在1和10μmol/L FeCl_3溶液刺激后,Onhjv表达量在肝脏、脾脏、肠和鳃等组织,以及头肾单核/巨噬细胞和肝细胞中的表达量也呈显著上调。受重组罗非鱼IL-6蛋白[(r)OnIL-6]刺激后,头肾单核/巨噬细胞中Onhjv表达量显著上调,表明炎症因子可以促进Onhjv表达。研究表明,尼罗罗非鱼铁调素调节蛋白在宿主抵御病原菌感染和维持铁稳态的过程中发挥作用。本实验为探究HJV在硬骨鱼中的生物学功能提供了参考,同时为进一步研究铁代谢在宿主防御病原菌感染过程中的重要作用提供理论指导。     

尼罗罗非鱼Siglec-4b like基因的克隆与表达特性分析

从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)嗜中性粒细胞中克隆了唾液酸结合型免疫球蛋白凝集素Siglec-4b like基因,对其进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测:1)早期胚胎发育过程的表达;2)成鱼组织中的分布;3)人工感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,GBS)后组织表达的变化。结果表明,尼罗罗非鱼Siglec-4b like具有与哺乳类Siglec-4相似的特异性结构域及保守氨基酸残基;早期胚胎发育Siglec-4b like基因在卵子中有一定表达量,受精后7 h即卵裂期表达上调,随后表达下降;Siglec-4b like基因在所检测的各组织中均有表达,鳃的表达量最高,其次是肌肉、皮肤、头肾和肠,其他组织的表达量较低;人工感染无乳链球菌后,Siglec-4b like在鳃、肾与肠等多个组织的表达均呈下调趋势。研究结果为进一步开展Siglec-4b like对罗非鱼免疫系统的调控作用及其与无乳链球菌免疫逃逸机制关系的研究奠定基础。     

尼罗罗非鱼CD2-like基因克隆及其胞外区表达研究

依据数据库中预测的尼罗罗非鱼白细胞分化抗原2(CD2)基因(GenBank登录号:XM_005460661.4)序列,采用PCR扩增体质量(150±50) g尼罗罗非鱼CD2分子同源类似物(CD2-like)基因编码区片段,然后以其胞外区构建原核表达质粒pGEX-6P1-CD2L,并进行原核表达及条件优化,最后进行复性纯化,为进一步研究该CD2-like分子在罗非鱼中的免疫功能奠定基础。研究结果表明,罗非鱼CD2-like(OnCD2-like)基因(GenBank登录号:MN296489)编码区全长1110 bp,其中胞外区长558 bp。构建OnCD2-like胞外区的原核表达质粒pGEX-6P1-CD2L,将该重组质粒导入大肠杆菌BL21后,成功表达OnCD2-like胞外段重组蛋白。原核表达结果显示,目的蛋白分子质量为20 ku,主要以包涵体形式存在,而该包涵体蛋白复性纯化最佳条件为:37℃下,0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6 h,经梯度稀释复性并纯化后可成功获得目的重组蛋白。     

佛罗里达红罗非鱼黑色素浓集激素1基因的克隆与表达分析

采用同源克隆技术获得了佛罗里达红罗非鱼(Oreochromis sp.)前原黑色素浓集激素1(prepro-melanin concentrating hormone 1,pmch1)基因c DNA全长序列,将其命名为flpmch1;并通过实时荧光定量PCR(q RTPCR)分析天生黑斑佛罗里达红罗非鱼组织表达谱和低温胁迫后其各组织表达差异。结果表明,flpmch1 c DNA序列全长629 bp,开放阅读框411 bp,编码136个氨基酸,存在12个潜在磷酸化位点和1个长度为199 bp的Cp G岛。Flpmch1与24个物种Pmch1氨基酸序列比对结果表明,Flpmch1与尼罗罗非鱼(O.niloticus)、奥利亚罗非鱼(O.aureus)、莫桑比克罗非鱼(O.mossambicus)、布氏新亮丽鲷(Neolamprologus brichardi)的Pmch1相似性最高。系统进化树分析显示硬骨鱼纲Pmch聚成一个大支,Flpmch1与尼罗罗非鱼Pmch1进化地位最接近。组织表达谱分析显示,flpmch1 m RNA在多个组织中均有表达,其中在脑中表达量最高,且粉白色皮肤中的表达量显著高于黑色皮肤(P0.01)。低温胁迫后flpmch1 m RNA各组织表达量较对照组均呈下调表达。推断flpmch1可能参与了佛罗里达红罗非鱼天生黑斑的形成和过冬黑化过程。     

不同水温下无乳链球菌在尼罗罗非鱼体内的动态分布及其消除规律

本研究以腹腔注射无乳链球菌(Streptococcus agalactiae, WC1535菌株)后的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)为研究对象,研究不同水温下无乳链球菌在尼罗罗非鱼体内的动态分布及消除规律。首先,分析25℃、29℃和33℃3个实验组罗非鱼的感染累积死亡率;其次,对3个实验组罗非鱼进行无乳链球菌的体外分离、培养和计数;然后,分析感染后不同实验组罗非鱼脑、肝脏、脾脏和肾脏组织中无乳链球菌的浓度。结果显示,随着水温的升高罗非鱼的累积死亡率也随之升高,25℃、29℃和33℃组的累积死亡率分别为6.67%、25.56%和78.90%。菌落统计结果显示,随着水温的升高,无乳链球菌在罗非鱼体内的增殖速度加快,同时,单位质量组织(脑、肝脏、脾脏和肾脏)中无乳链球菌的最大载菌量也随之升高。本研究还发现,无乳链球菌在罗非鱼脾脏中的浓度最高,在肾脏中的存活时间最长。综上可知,尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后,体内各组织中链球菌的增殖、消除速度均与水温密切相关。本研究为研究无乳链球菌的致病机制奠定基础,也为通过合理调控水温及施药等措施防治尼罗罗非鱼链球菌病的暴发提供科学依据。     

尼罗罗非鱼E-钙黏着蛋白的基因克隆及组织表达分析

克隆尼罗罗非鱼E-钙黏着蛋白(On-ECdh)基因,分析On-ECdh基因生物信息学特征及其在正常和无乳链球菌刺激后的尼罗罗非鱼组织中的表达情况.设计基因特异引物扩增On-ECdh基因片段,采用生物信息学对其序列进行分析,利用荧光定量PCR技术检测On-ECdh基因的表达模式.On-ECdh基因开放阅读框为2442 b...     

文蛤CDK1基因在选育与自然群体早期生长阶段中的表达特征

为探究细胞周期素依赖性激酶1（CDK1）在选育群体红文蛤和自然群体黄文蛤（）的cDNA序列，该基因cDNA序列全长为1623 bp，其中包括353 bp的5''末端非翻译区（UTR），370 bp的3''UTR，900 bp的开放阅读框（ORF），共编码299个氨基酸。预测氨基酸序列具有较高的保守性，包含STKc-CDK1-euk结构域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族特征序列DLKPQN和G/V-T/S-X-X-Y/F-X-A-P-E、与cyclin B结合相关的保守序列PSTAIRE，以及与ATP相结合的保守序列GXGXXG和K33。组织表达结果显示，基因在各个组织中广泛表达，其中性腺中的表达量最高，其次是外套膜。不同条件（光照、饵料）培育实验中，光照强度分别为2.16~778 Lux和1.48~70.6 Lux，饵料密度分别为20×10⁴ ind/mL和5×10⁴ ind/mL，结果显示，红文蛤苗种表现出比黄文蛤苗种更快的生长速度；各养殖条件下<0.05）。由此推测，基因在文蛤苗种生长中发挥重要作用，且选育后的红文蛤较黄文蛤拥有更好的生长性能。本实验将为进一步研究文蛤生长发育相关机制提供参考，也为文蛤新品种选育奠定理论基础。     

牙鲆efhd2和tbc1d25基因的克隆和表达分析

为在分子水平解析牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗淋巴囊肿病的机理,本研究克隆牙鲆淋巴囊肿抗病免疫相关基因efhd2和tbc1d25的c DNA全序列,运用生物信息学方法对基因序列进行了详细分析;同时,采用荧光定量PCR分析了efhd2和tbc1d25基因在牙鲆胚胎发育不同阶段、淋巴囊肿抗病和患病个体不同组织的表达特征。结果显示,efhd2基因c DNA全长为5231 bp,开放阅读框(ORF)长为699 bp,编码232个氨基酸。tbc1d25基因c DNA全长为3173 bp,ORF长为2601 bp,编码866个氨基酸。定量结果显示,efhd2和tbc1d25基因在胚胎发育的各个时期均有不同程度的表达,其中,efhd2在出膜仔鱼期表达量最高,而tbc1d25在受精卵中的表达量显著高于其他时期(P0.05)。在所研究的淋巴囊肿抗病和患病个体不同组织中,efhd2和tbc1d25基因均有不同程度的表达,抗病个体的血液中,这2个基因的表达量均显著高于患病个体(P0.05)。本研究结果为深入探讨efhd2和tbc1d25基因功能和解析牙鲆淋巴囊肿抗病机理提供了基础资料。     

凡纳滨对虾ARMC8基因的克隆及表达

为了研究含Armadillo重复蛋白8在凡纳滨对虾抗病感染过程中所起的免疫作用,本实验采用RACE-PCR技术首次克隆得到凡纳滨对虾ARMC8基因(LvARMC8,Gen Bank注册号:KX058562)的c DNA序列全长,并利用在线软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(Rt-PCR)技术对LvARMC8基因在凡纳滨对虾不同组织及感染白斑综合征病毒和副溶血弧菌过程中的表达变化特征进行分析。结果显示,LvARMC8基因全长为2917bp,其中开放阅读框长2046 bp,编码681个氨基酸,5′非编码区长49 bp,3′非编码区长822 bp。预测分析显示LvARMC8编码的蛋白质含有6个ARM结构域。同源性分析发现,LvARMC8基因与内华达古白蚁ARMC8基因的相似度最高,为71%。系统进化分析结果显示,LvARMC8和多种无脊椎动物ARMC8聚为一支,其中与昆虫类动物赤拟谷盗、致倦库蚊和柑橘凤蝶的亲缘关系最近。Rt-PCR分析发现,LvARMC8基因在凡纳滨对虾多个组织中均能检测出,在表皮中表达量最高,眼柄中表达量最低。WSSV感染后12 h,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量显著降低,但48 h后显著升高,72 h达到最高水平。除副溶血弧菌感染后24 h外的时间点,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量均显著升高。研究表明,LvARMC8基因可能参与凡纳滨对虾抗病免疫应答途径。     

中华鳖Gper基因克隆、表达及其在精巢中的功能

G蛋白偶联雌激素受体（Gper）是一种膜雌激素受体，介导雌激素的非基因组途径。为研究G蛋白偶联雌激素受体基因（ cDNA全长序列，利用qRT-PCR分析其在不同组织及胚胎不同发育阶段的性腺中的表达模式，并通过来曲唑（letrozole）和Gper抑制剂G-15处理雄鳖初步分析Gper在精巢中的作用。结果显示，中华鳖 cDNA序列全长2023 bp，包含705 bp 5''非编码区、241 bp 3''非编码区和1077 bp开放阅读框，编码358个氨基酸，其氨基酸序列上有7个跨膜结构域和Asp-Arg-Tyr（DRY）三联体结构，基因编码蛋白分子量为41.084 kD，等电点为6.844。表达量变化呈相同趋势：16期表达量最高，随着性腺分化过程表达量显著降低。Letrozole处理组中2表达量明显升高；G-15处理组精巢中，精子发生与促细胞凋亡相关基因表达量显著升高。结果表明，可能参与中华鳖性腺分化早期过程，并调控雄性生殖细胞增殖。     

缢蛏2-CRD型半乳糖凝集素(Galectin)基因的克隆和表达分析

利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了缢蛏半乳糖凝集素基因(ScGL)。ScGL全长为1 282 bp,5′非编码区35 bp,3′非编码区329 bp,开放阅读框(ORF) 918 bp,编码305个氨基酸。氨基酸序列分析显示,ScGL无跨膜结构域,与已报道的缢蛏半乳糖凝集素含1个糖识别结构域(CRD)不同,ScGL具有2个CRD。相似性分析显示,ScGL与其他软体动物的半乳糖凝集素具有较高的相似性,与菲律宾蛤仔相似性最高,达65%;与已报道的2个缢蛏半乳糖凝集素相似性分别为39.74%和44.76%。系统进化上ScGL与菲律宾蛤仔半乳糖凝集素聚为一支。重组表达发现ScGL在包涵体表达,分子量约34.4 ku。荧光定量PCR分析显示,ScGL在缢蛏鳃、肠、唇瓣、外套膜、出水管、入水管、足和内脏团中均表达;其中肠、内脏团、唇瓣和足中表达量较高,出水管和入水管中表达量最低。消化腺ScGL表达量分别在金黄色葡萄球菌感染后3 h和48 h显著高于对照组;鳃ScGL表达量分别在鳗弧菌和金黄色葡萄球菌感染后6 h和48 h显著高于对照组,说明ScGL参与了病原体诱导的缢蛏免疫应答。本研究为深入探索ScGL在缢蛏免疫中的作用奠定基础。     

海蜇(Rhopilema esculentum)Notch基因的cDNA克隆和表达

基于转录组454 GS FLX测序结果,利用RACE和RT-PCR技术克隆了海蜇(Rhopilema esculentum) Notch基因的cDNA全长,并分析了其mRNA在海蜇不同发育阶段的表达差异,以探讨Notch基因对海蜇无性生殖的影响.结果显示,海蜇Notch基因的cDNA全长为6768 bp,包括90 bp的5'非编码区、6066 bp的开放阅读框及612 bp包含AATAAA加尾信号的3'非翻译区.SMART分析表明,海蜇Notch为分泌蛋白,其信号肽由21个氨基酸组成.成熟肽由2000个氨基酸组成,包括37个结构域、26个表皮生长因子样结构域、3个富含半胱氨酸的Notch/Lin-12(NL)结构域、1个NOD结构域、1个NODP结构域、1个跨膜结构域和6个锚蛋白结构域ANK,并含有25个N-糖基化位点.同源分析表明,海蜇Notch与来自刺胞动物门的海葵(Nematostella vectensis)的Notch相似性为39％,与无脊椎动物和脊椎动物的氨基酸相似度分别为35％-37％和34％-38％.RT-PCR分析表明,Notch基因在海蜇无性繁殖的4个发育时期均有表达,螅状体阶段的表达量最高,横裂体阶段表达量最低,螅状体的表达量是横裂体的1.85倍.这些研究结果为进一步研究Notch信号通路在海蜇无性繁殖中的调控作用奠定了基础.     

中华鳖dazl基因克隆及在生殖细胞中的表达

为探索龟鳖类生殖细胞的发育分化机制,实验通过特异性引物克隆了中华鳖dazl基因的cDNA片段,长1 007 bp,其中包括5′端非编码区197 bp,3′端非编码区33 bp,开放阅读框777 bp,编码258个氨基酸。氨基酸序列比对显示其与西部锦龟Dazl同源性最高,达96%;与小鼠Dazl同源性达75%。荧光定量PCR分析结果显示,中华鳖dazl mRNA主要在精巢和卵巢中表达,在体细胞组织中仅检测到微量表达。冰冻切片原位杂交结果显示,中华鳖dazl mRNA在生殖细胞中特异表达,且在不同时期的生殖细胞中呈动态表达模式。在精巢中,中华鳖dazl mRNA在初级和次级精母细胞中表达最强,在精原干细胞中表达水平次之,在精子细胞中未检测到信号;在卵巢中,中华鳖dazl mRNA信号在初级卵母细胞胞质中均匀分布且在最早期的初级卵母细胞中信号最强,随着卵母细胞的增大,信号逐渐聚集并逐渐减弱。研究表明,dazl基因可能对中华鳖两性生殖细胞的发生具有重要的调控作用。     

日本沼虾细胞自噬基因ATG13和ATG101的克隆及其低氧胁迫下表达分析

为研究自噬相关基因(autophagy-related genes, ATG) ATG13和ATG101在甲壳动物应答低氧胁迫过程中的调节作用,实验采用RACE PCR技术通过克隆测序和基因序列拼接,首次克隆了日本沼虾的细胞自噬基因ATG13和ATG101的全长cDNA序列,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13 cDNA全长2 043 bp (NCBI登录号为MT084347),包括211 bp的5′末端非翻译区(untranslated region,UTR),449 bp的3′UTR和1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),开放阅读框编码460个氨基酸;ATG101 cDNA全长1 051 bp(NCBI登录号为MT084348),包括18 bp的5′末端非翻译区,373 bp的3′UTR和660 bp的开放阅读框,开放阅读框编码219个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13富含高度保守的LC3作用结构域(LIR);系统进化树分析显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13与凡纳滨对虾ATG13具有最近的亲缘关系;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)实验分析发现,日本沼虾ATG13和ATG101在其肝胰腺和脑组织表达量较高,而在肌肉中表达量较低;利用qRT-PCR追踪其在肝胰腺组织低氧胁迫过程中出现的表达差异情况,结果显示,实验组日本沼虾在低氧胁迫6和24 h时,其细胞自噬基因ATG13和ATG101表达量显著高于对照组,而在复氧12 h后,实验组与对照组的ATG13和ATG101表达量差异不显著;Western blot分析结果显示,日本沼虾ATG13和ATG101表达丰度基本与基因表达模式相似。透射电镜分析结果显示,在低氧胁迫6和24 h后,肝胰腺组织中的溶酶体开始出现自噬空泡,表明急性低氧胁迫会诱导自噬体的形成,本研究结果可为了解日本沼虾应对低氧胁迫下的调控机制提供理论参考。     

杂色鲍HSP90基因启动子的功能分析

为探索启动子在热休克蛋白90表达调控中的作用,本研究在课题组已有杂色鲍HSP90基因cDNA的基础上,通过Genome walking、Tail-PCR和常规PCR等技术克隆获得该基因的5′调控区序列。在翻译起始位点(ATG)和第一外显子(长度94 bp)之间有一个809bp的内含子,第一外显子之前的5′调控区共2800 bp,从预测的转录起始位点(A)起,共2811 bp。在转录起始位点(A)上游–30 bp处存在TATA box。潜在的转录因子结合位点包括ATF、TBP、Sp1、Oct-1、C/EBPalpha、NF-1、NF-κappa B、GATA-1、Sox-2等。CpG岛预测软件分析其含1个CpG岛,长度为131 bp。实验构建了8个启动子缺失片段的萤火虫荧光素酶表达载体,通过瞬时转染293T细胞并进行双荧光素酶报告基因活性检测,确定杂色鲍HSP90基因核心启动子区位于–98~83 bp。在–624~–539 bp,Oct-1、C/EBPalpha、NF-1这3个转录因子都起到一定的抑制作用。